香蕉枯萎病菌4号生理小种smy1基因的功能分析

Smy1是一种参与调控真菌生长的驱动蛋白。本研究克隆了香蕉枯萎病菌4号生理小种（Foc 4）驱动蛋白基因smy1,并采用同源重组技术获得smy1敲除的野生型Foc 4的smy1敲除突变体。通过测定突变体菌丝形态、生长速度、产生孢子量、对香蕉苗的致病力及对氰烯菌酯的敏感性,用于研究smy1在香蕉枯萎病菌的生长发育及对氰烯菌酯抗药性中的作用。结果表明,与野生型Foc 4相比,smy1敲除突变体生长缓慢、菌丝畸形、产孢量增加,对巴西蕉苗的致病力减弱,但对氰烯菌酯的抗性水平变化不大。由此推断smy1基因可能在Foc 4的生长发育、产孢以及致病力等方面具有重要作用。     

香蕉枯萎病菌1号生理小种遗传转化体系的建立

利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法,建立香蕉枯萎病菌1号生理小种(Fusariumoxysporum f.sp cubense race 1)遗传转化体系,并对影响转化效率的因子进行优化,明确了高效转化的条件为:农杆菌OD600为0.15,AS诱导浓度为150μmol/L,诱导时间为7 h,Focr1-N2孢子浓度为1×106个/mL,潮霉素B筛选的浓度为150μg/mL,诱导培养基pH值为5.5,共培养温度为25℃,共培养时间为48 h为最佳条件。构建了包含1 200个突变体的突变体库,并对1 200个突变体进行了致病性测定,初步筛选出致病性丧失突变体20个,致病性显著减弱突变体18个,致病性严重增强突变体53个。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种致病性突变体△Focr4-1422生物学特性研究

为研究香蕉枯萎病菌4号生理小种致病性突变体相关致病基因的功能,研究了基因敲除子△Focr4-1422与野生型菌株193之间部分致病性相关的表型差异。结果表明,基因敲除子对巴西蕉的致病性减弱,荧光检测显示菌丝能够从根部扩散到根茎交界处的茎部。△Focr4-1422对细胞壁降解酶的抗性大大增强。基因敲除子△Focr4-1422和野生型193在相同的温度、pH值、光照条件和碳氮源培养基下的生长速率均没有达到极显著差异,两者的菌丝和孢子的致死温度也一致。     

香蕉枯萎病菌2个生理小种MAPK基因的克隆及序列分析

为了解香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)1号生理小种(race 1)和4号生理小种(race4)丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因focMK1,focMK4的序列差异,根据番茄枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)的MAPK基因相关序列设计引物,利用PCR和RT-PCR技术,分别克隆了香蕉枯萎病菌2个生理小种的基因序列和开放阅读框。结果表明,所获得的2个MAPK基因均含有3个内含子和4个外显子,2个基因序列只有一个碱基差异,编码氨基酸355个,氨基酸组成无差异;根据生物信息学软件预测编码蛋白没有信号肽,具有2个功能位点,分子量和pI分别为41ku和6.47。该基因编码的蛋白具有高度保守性,与大多数植物致病菌的同源性都在90%以上,不同病原镰刀菌间的同源性接近100%。     

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种在几种培养基上的生长特性

测定10株分离自广东省不同香蕉种植区的香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种在不同培养基上的形态、生长速率和产孢能力的差异。结果显示,不同生理小种菌株在PDA、Komada改良培养基、粉蕉组织浸提液培养基和香蕉组织浸提液培养基上的形态、生长速率和产孢能力等特性差异不明显,不能依据这些特性区分1号和4号生理小种;但在康乃馨叶片琼脂(Carnation leaf agar,CLA)培养基上产生的孢子形态具有明显差异,4号生理小种的菌株产生典型的尖镰刀状大孢子,孢子多6个隔,长约(36.80±5.33)～(44.93±4.80)μm,宽约(3.40±0.20)～(4.27±0.25)μm,占总孢子数的比例较大,为(40.87±9.67)%～(62.50±7.84)%,而1号生理小种个体产生的大型孢子前端钝圆,弯曲程度低,多4个隔,孢子长约(22.31±3.89)～(25.01±6.16)μm,宽约(3.42±0.23)～(3.90±0.24)μm,占总孢子数的比例很小,为(2.55±1.95)%～(4.50±1.76)%。     

香蕉枯萎病菌的致病性测定及其RAPD分析

以分离自海南、广东的18个香蕉枯萎菌菌株为试验材料,进行致病性测定及RAPD分析.结果表明,分离自粉蕉的12个菌株为1号生理小种,而分离自巴西蕉的6个菌株为4号生理小种;1号生理小种菌株侵染粉蕉的发病率与4号生理小种菌株侵染粉蕉、巴西蕉的发病率都是100%;采自海南三亚市荔枝沟镇的15号菌株为强致病性的菌株,与其它5个4号小种菌株相比,差异显著;RAPD分析能区分1号4号生理小种,菌株的地理来源,致病力;引物OPM-15能用来鉴定1号和4号生理小种.     

香蕉枯萎病菌4号生理小种β1-微管蛋白基因的功能分析

本研究克隆并鉴定香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)β1-微管蛋白(β1-tub)基因,采用Split-marker同源重组技术获得Foc4的β1-tub基因敲除突变体,通过测定突变体菌株的生长速度、产孢量、致病力及对多菌灵敏感性,研究β1-tub基因在香蕉枯萎病菌的生长发育及对多菌灵抗药性中的作用。结果表明：与Foc4野生型菌株相比,敲除突变体生长缓慢、菌丝畸形及产孢量增加,对巴西蕉苗的致病力明显减弱,但对多菌灵的抗性水平无明显变化。由此推测β1-tub基因可能在Foc4的生长发育、产孢及致病力等方面具有重要的作用。     

香蕉枯萎病菌及其粗毒素对香蕉的致病性比较

从8种培养液中筛选出能诱导香蕉枯萎病菌4号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4)FOCAAA315菌株高产毒素的改良CzapekB培养液,FOCAAA315菌株在该培养液中培养第15d,镰刀菌酸(FA)产量高达669.2mg/L,蔗糖为诱导产毒的最佳碳源。采用伤根浸渍法接种,测定枯萎病菌和病菌发酵粗毒素对香蕉组培苗的致病性。结果表明,粗毒素接种可诱发与病原菌类似的病害症状。受侵染的植物组织在细胞水平上发生一系列形态结构和生理生化代谢的病理变化,包括细胞壁消解、侵填体堵塞气腔、粘胶质减少、淀粉量减少、细胞木质化和黄褐色胶状物堵塞导管等。香蕉枯萎病菌的粗毒素是重要的致病化学物质;利用病菌孢子悬浮液在香蕉苗期接种,可以作为室内快速鉴定香蕉品种抗病性的方法。     

一种简便分离香蕉枯萎病菌的选择性培养基

为探寻在非无菌操作下能从土壤中快速且大量分离检测香蕉枯萎病菌,研制了一种用于检测香蕉枯萎病病原菌的选择性培养基-PCEA,其成分为:马铃薯200 g,CuSO_4·5H_2O 0.5 g,MgSO_4·7H_2O 0.6 g,KH_2PO_4 0.1 g,敌克松结晶粉(75%)3 g,硫酸链霉素0.75 g,95%酒精10mL,水1 000mL,pH5.8,琼脂18～20g.该培养基与其它常见分离培养基相比,无需无菌操作,且成分简单、检测率显著,抑菌效果好,病菌在其上生长快、菌落典型,是一种较为理想的选择性培养基.     

内生拮抗细菌BEB2的分子鉴定及其对香蕉枯萎病菌的抑制作用

利用聚合酶链式反应(PCR)方法对细菌BEB2做进一步的分子鉴定,并研究不同温度、pH值和培养基下BEB2发酵液对香蕉枯萎病菌生长的抑制能力.以及应用BEB2对香蕉枯萎病进行防治测试.结果发现,香蕉内生拮抗细菌BEB2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);不同温度、pH值和培养基下的BEB2发酵液对香蕉枯萎病菌生长的抑制能力具显著差异,在King B2培养基上抑菌作用最强,最适抑菌温度为32℃,最适抑菌pH值为9.0.香蕉枯萎病盆栽防治实验结果发现,菌株接种离体叶片和植株均表现出一定的抑制活性,防治效果良好;该菌株连续20次转接培养,遗传稳定性高,抑菌谱较宽,具一定的生防应用价值.     

香蕉枯萎病菌fga1基因的克隆与序列分析

为了解fga1基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间的致病力差异的关系,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的fga1基因,并对扩增产物进行了测序及相似序列搜索和比对,还对基因编码的蛋白进行了氨基酸序列比对和功能分析.研究结果表明2个生理小种fga1基因开放阅读框均为1 062 bp,编码353个氨基酸,基因同源性为99.5%,氨基酸序列相同.推测fga1基因可能与香蕉枯萎病菌自身繁殖和附着胞的形成有关.从fga1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列看,2个生理小种致病力的差异与fga1基因并无明显对应关系,这为进一步研究fga1基因功能奠定了基础.     

香蕉枯萎病菌cyp1基因的克隆与序列分析

为了解亲环素基因(cyp1,其编码亲和蛋白)在尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间及与其他镰刀菌之间的差异,分析cyp1基因与两生理小种之间的寄主选择性差异的关系,通过比对现有镰刀菌属的亲环素基因序列,设计并合成引物,采用PCR和RT-PCR方法扩增了尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号2个生理小种的cyp1基因,并测序进行比较分析,同时对编码蛋白进行了氨基酸序列比对和功能分析。结果表明,2个生理小种cyp1基因全长均为1066bp,开放阅读框均为675bp,编码224个氨基酸,基因序列间差异性为0.8%,编码蛋白间仅存在1个氨基酸的差异;两生理小种的cyp1基因序列与镰刀菌属其他专化型或不同种间存在差异性,与不同属之间其他种间的差异最大达50%,比对蛋白序列发现仅存在0.85%的差异,这进一步证明亲和蛋白在真菌中较保守。从cyp1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列在两生理小种之间的差异性分析结果推测,2个生理小种寄主选择性差异与cyp1基因并无明显对应关系,这为进一步研究cyp1基因功能奠定了基础。     

培养基营养成分对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌生长的影响

通过对香蕉枯萎病发病株病组织的分离、纯化,得到香蕉枯萎病病原菌--尖镰孢菌古巴专化型[Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder et Hansen].该病原菌在不同pH值培养基上培养4 d后,发现尖孢镰刀菌菌落在pH值4.0～9.0范围内均可生长,pH值为6.0～7.0时最适,菌落直径平均在3.7～3.9 cm之间.尖孢镰刀菌在不例营养成分的培养基上培养,结果表明,N源对尖孢镰刀菌菌丝的生长影响大于C源.生长到第6天时,全糖型培养基产孢量最大,且小型分生孢子的产孢量也最大,可使香蕉苗发病率达到100%.而大型分生孢子的产生最佳培养基为低氮型培养基.     

巴西蕉诱导的香蕉枯萎病菌1号和4号小种致病相关基因表达分析

目前对于香蕉枯萎病菌的致病分子机制尚不十分清楚。为了阐明枯萎病菌的致病分子机制,从香蕉枯萎病菌1号(Foc1)和4号小种(Foc4)的比较蛋白质组学分析发现的表达量差异较大的蛋白中,选取了9个致病相关蛋白或潜在的致病基因,利用荧光定量PCR方法进行基因表达谱分析。结果显示：与对照相比,巴西蕉处理的Foc4中,上调表达的基因有：酰胺转移酶基因（amidotransferase）、线粒体过氧化物还原酶基因（mitochondrial peroxiredoxin）、几丁质酶基因（chitinnase 1）、羧肽酶基因（carboxypeptidase cpds）,差异表达不明显的有腺苷激酶基因（adenosine kinase）、NADP-依赖型甘油脱氢酶基因（NADP-dependent glycerol dehydrogenase）、磷酸甘油酸激酶基因（phosphoglycerate kinase）、谷胱甘肽还原酶基因（glutathione reductase）、酰胺酶基因（amidase family protein）。Foc1中,与对照相比,上调表达的基因有：腺苷激酶基因、NADP-依赖型甘油脱氢酶基因,下调表达的基因有：酰胺转移酶基因、羧肽酶基因。综合分析显示,酰胺转移酶、过氧化物酶、几丁质酶、羧肽酶基因可能在Foc4的致病作用中起作用。     

香蕉枯萎病菌pgx4基因的克隆与序列分析

为了解pgx4基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间的致病力差异的关系,以尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种和4号生理小种的基因组DNA和cDNA为材料,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的pgx4基因,并对扩增产物进行克隆测序后再用生物信息学软件对序列进行比对分析.结果表明:2个生理小种pgx4基因的开放阅读框均为1 395 bp,编码465个氨基酸,且前17个氨基酸均构成该基因的信号肽.通过DNAStar 7.1比对发现,尖孢镰刀菌古巴专化型2个生理小种pgx4基因的核苷酸序列存在25个碱基的差异,而其编码的465个氨基酸中,也有3个氨基酸不同,分析这些核苷酸序列和氨基酸序列的差异可能与尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种和4号生理小种在侵染蕉类不同栽培种时的识别专性寄主机制有一定关系.     

香蕉枯萎病菌pacC基因的克隆与序列分析

采用PCR和RT-PCR方法扩增尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f sp.cubense,FOC)1号和4号生理小种的pacC基因(FOC1-pacC,FOC4-pacC),对FOC1-pacC和FOC4-pacC相似序列进行搜索和比对,以及对基因编码蛋白进行结构预测,发现FOC1-pacC和FOC4-pacC开放阅读框分别为1 863、1 905 bp,编码634、620个氨基酸,2个小种之间基因序列和氨基酸序列差异明显,FOC1-pacC比FOC4-pacC缺少1个基因片段,FOC-pacC与其相似序列有显著差异,比对缺少2个基因片段;初入侵转录组表达分析说明,2生理小种pacC基因在小种侵染不同品种香蕉过程中表达有差异,FOC1-pacC基因只在粉蕉中检测到表达,而FOC4-pacC则在粉蕉和香蕉中都检测到表达,但在粉蕉中的表达量明显高于香蕉。