无核葡萄胚珠培养技术研究

对以无核葡萄为母本的9个杂交组合的杂交后代及无核品种的实生后代进行了胚珠培养。结果表明,母本对胚萌发率起着关键作用;大果的胚珠萌发率高;金星无核的最佳胚珠培养基为N itsch+水解酪蛋白100mg/L+活性炭2.0g/L+IAA 1.8mg/L+GA 0.4mg/L+糖20g;喙切可以大大提高金星无核胚珠的萌发率。研究了异常苗、畸形苗、白化苗的成苗情况,确定了相应的成苗培养基;并建立了各杂交组合后代和不同品种的实生后代适宜的快繁培养基。     

葡萄无核基因的SCAR标记及Southern blot分析

根据无核基因特异RAPD标记的序列进行分析,合成1对特异引物P1+P3(序列分别是P1:5′CTCATCTTCTTGATGGTGAT3′;P3:5′AAGTGAAGAACATCATTAAGAAC3′),对30个葡萄材料进行PCR扩增,成功地将RAPD标记转换成SCAR标记。并对含有该标记序列的重组质粒进行Hind 和Spe 双酶切,获得的310bp片段回收后制成探测葡萄无核基因存在与否的杂交探针,成功地对7个葡萄品种进行Southernblot分析,实现了分子标记检测葡萄无核基因的目的。     

提高无核葡萄胚挽救中幼胚成苗率的研究

 【目的】提高无核葡萄胚挽救中幼胚的成苗率。【方法】以7个杂交组合的胚珠为试材,研究不同基因型、不同胚珠发育培养基、添加不同氨基酸及低温处理采后幼果对无核葡萄胚成苗率的影响。【结果】在无核葡萄胚离体发育中,母本和父本对胚的成苗均有影响;在二倍体无核葡萄作母本的杂交组合中,以二倍体无核葡萄作父本比以四倍体有核葡萄作父本更有利于胚的成苗。在3种不同配方的培养基中,适宜于无核葡萄离体幼胚发育和成苗的培养基是MM4。ER添加4 mmol?L-1脯氨酸培养基最有利于无核葡萄胚的发育。低温处理3 d对红宝石无核×森田尼无核和红宝石无核×黑奥林胚的成苗促进最大。【结论】无核葡萄胚挽救的适宜培养基是ER+4 mmol?L-1脯氨酸或MM4培养基,低温处理幼果3 d能有效提高二倍体无核葡萄×二倍体无核葡萄胚挽救中胚的成苗率。     

Gene cloning and expression analyses of WBC genes in the developing grapevine seeds

White-brown complex (WBC) transporters, also called half-size ATP binding cassette G (ABCG) transporters, are involved in many biological processes, including seed development; however, the WBC transporters in grapevines received less attention to date. To reveal the molecular characteristics of WBCs and the connection between WBCs and agronomic traits of stenospermocarpic (seedless) grapevine, we carried out a genomic census and analysis of ovule-associated expression for VvWBC genes in grapevine. We identified 30 VvWBC genes and cloned full-length complementary DNAs (cDNAs) for 20 of these. The tissue or organ-specific expression analysis showed that several VvWBCs exhibited distinct expression patterns with some showing tissue specificity. Twelve VvWBC genes were found to be expressed in the developing ovules. Moreover, the results of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) suggested that four of twelve ovule-expressed VvWBCs have distinct expression profiles during the development of ovules between seeded and stenospermocarpic grapevines. These four genes might be involved in ovule abortion. Meanwhile, chromosome mapping, multiple sequence alignments, exon/intron structure analyses and synteny analyses were preformed on VvWBC genes. Our experiments provide a new perspective on the mechanism of stenospermocarpic seedlessness and put forward a framework for further study of WBC transporters.     

Establishment and application of an SNP molecular identification system for grape cultivars

We aimed to develop a set of single nucleotide polymorphism (SNP) markers that can be used to distinguish the main cultivated grape (Vitis L.) cultivars in China and provide technical support for domestic grape cultivar protection, cultivar registration, and market rights protection. A total of 517 high-quality loci were screened from 4 241 729 SNPs obtained by sequencing 304 grape accessions using specific locus amplified fragment sequencing, of which 442 were successfully designed as Kompetitive Allele Specific PCR (KASP) markers. A set of 27 markers that completely distinguishes 304 sequenced grape accessions was determined by using the program, and 26 effective markers were screened based on 23 representative grape cultivars. Finally, a total of 46 out of 48 KASP markers, including 22 markers selected by the research group in the early stage, were re-screened based on 348 grape accessions. Population structure, principal component, and cluster analyses all showed that the 348 grape accessions were best divided into two populations. In addition, cluster analysis subdivided them into six subpopulations. According to genetic distance, V. labrusca, V. davidii, V. heyneana, and V. amurensis were far from V. vinifera, while V. vinifera×V. labrusca and V. amurensis×V. vinifera were somewhere in between these two groups. Furthermore, a core set of 25 KASP markers could distinguish 95.69% of the 348 grape accessions, and the other 21 markers were used as extended markers. Therefore, SNP molecular markers based on KASP typing technology provide a new way for mapping DNA fingerprints in grape cultivars. With high efficiency and accuracy and low cost, this technology is more competitive than other current identification methods. It also has excellent application prospects in the grape distinctness, uniformity, and stability (DUS) test, as well as in promoting market rights protection in the near future.     

葡萄果粒质量相关性状全基因组关联分析

【目的】果粒大小是葡萄外观和产量的重要构成因子之一,为受多基因调控的复杂数量性状,挖掘葡萄果粒大小相关性状的关键遗传调控位点和基因,将有助于葡萄产量的提高。【方法】本研究以150份葡萄品种资源为材料,分别于2019年和2020年对葡萄果实单粒重、种子数目和种子质量等进行测定,并结合重测序获得的高密度基因型数据进行全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS）,挖掘调控各性状的遗传位点和基因。【结果】各性状在关联群体中呈现广泛的连续变异,变异系数为39.55%—68.89%;在不同年份均服从正态分布,符合数量性状遗传特征;相关性分析表明葡萄果实单粒重、种子数目和种子质量呈显著正相关。全基因组关联分析共检测到150个与果实单粒重显著关联的SNP,在2019年检测到99个SNP,解释表型变异的14.48%—25.59%;在2020年检测到73个SNP,解释表型变异的16.08%—26.83%;其中24个SNP位点在两个年份均检测到,主要位于1号、5号、11号和16号染色体。相较于果实单粒重,检测到的与种子数目显著关联的SNP较少,2019年检测到1个...     

抗寒无核葡萄杂种胚挽救及分子标记辅助选择

【目的】利用胚挽救技术创制抗寒无核葡萄新种质,为选育抗寒无核葡萄新品种奠定基础。【方法】分别以抗寒欧美杂交无核葡萄品种‘Jupiter’和欧山杂种有核优系‘00-1-5’(‘玫瑰香’ב山葡萄黑龙江实生’)为父本,5个欧亚种无核品种‘Ruby Seedless’‘秦红1号’‘秦红2号’‘Crimson Seedless’和‘秦秀’为母本杂交,在各母本最佳胚珠取样时期取样,以固-液双相培养基MM3和ER分别作为胚发育培养基进行胚珠培养,比较不同母本和2种培养基对胚发育率、萌发率、成苗率及畸形苗率的影响;以WPM+0.2 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 IAA固体培养基作为胚萌发培养基,获得胚挽救后代,经炼苗后移栽至田间;分别在2MS+0.2 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 IAA培养基中添加0、1.0和1.6 mg·L^-1 ZnSO₄进行畸形苗转化正常苗培养,以筛选最适宜转化培养基;利用无核基因分子标记SCF27-2000对胚挽救...     

vvi-miR160s介导VvARF18应答赤霉素调控葡萄种子的发育

【目的】研究vvi-miR160家族(vvi-miR160s)及其靶基因在‘魏可’葡萄种子发育过程中的作用,探究其应答赤霉素(GA)调控葡萄果实无核的潜在机理。【方法】采用miR-RACE、生物信息学分析、RT-qPCR、RLM-RACE等方法,鉴定vvi-miR160家族成员及其靶基因,分析vvi-miR160s及其靶基因应答GA的时空表达模式及其潜在功能。【结果】花前GA处理强烈抑制‘魏可’葡萄胚珠及种子发育,高效诱导其无核,且无核率达99.8%。克隆鉴定了VvMIR160s前体基因序列(501 bp)及成熟体序列,且它们在不同物种间具有较高的保守性;基于vvi-miR160s序列,预测到靶基因VvARF18,利用RLM-RACE技术检测到vvi-miR160s对VvARF18的裂解位点在第10和第11位之间,裂解频度9/17,证明VvARF18是vvi-miR160s的真实靶基因。该靶基因编码683个氨基酸,在398—411位存在核定位信号,且该蛋白亚细胞定位于细胞核上。VvARF18与其他物种间序列的同源保守性较高,基因结构相似,其中VvARF18蛋白与茶、烟草、梅花等物种亲缘...     

葡萄无核基因分子标记的通用性鉴定

【目的】无核是鲜食葡萄的重要农艺性状,无核基因分子标记的准确性将影响无核葡萄早期选择的效果。本研究对前人开发的5个葡萄无核基因分子标记在183份葡萄材料中进行通用性鉴定,旨在明确各个分子标记的适用范围,为利用分子标记辅助无核葡萄育种提供参考依据。【方法】以96个葡萄品种（其中无核63个,有核33个）及‘红地球’ב黎明无核’87个F₁单株（其中无核61株,有核26株）的叶片DNA为模板,利用已报道的5个葡萄无核基因分子标记（SCF27-2000、GSLP1-569、VMC7f2、p3_VvAGL11和5U_VviAGL11）的引物进行PCR扩增,采用1.5%琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳和8%聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测PCR产物,分析各个样品的无核特异条带,鉴定5个分子标记的准确率。【结果】SCAR标记GSLP1-569对96个葡萄品种的检测准确率为40.6%,无核检测率为63.6%。SCAR标记SCF27-2000对96个葡萄品种及87个F₁杂交单株的检测准确率分别为71.9%和76.54%,无核检测率分别为70.5%和78.5%。SSR标记VMC7f2在96个葡萄品种中鉴定出8个等位基因,经卡方检验,189-bp等位基因与葡萄无核性状显著关联,其检测准确率为85.4%,无核检测率为85.5%。SSR标记p3_VvAGL11在96个葡萄品种中鉴定出7个等位基因,经卡方检验,187-bp等位基因与葡萄无核性状显著关联,其检测准确率为89.6%,无核检测率为90.7%,在F₁杂交单株中其鉴定准确率为87.65%,无核检测率为91.1%,假阳性率为6.17%,假阴性率为6.17%。SSR标记5U_VviAGL11在96个葡萄品种中鉴定出17个等位基因,经卡方检验,306-bp等位基因与葡萄无核性状显著关联,其鉴定准确率为88.5%,无核检测率为90.6%,在F₁杂交单株中检测准确率为88.89%,无核检测率为92.7%,假阳性率为4.94%,假阴性率为6.17%。【结论】SSR标记p3_VvAGL11和5U_VviAGL11在葡萄种质及遗传群体中无核分型的准确性及无核检测的效率较高,适用范围较广,在无核基因分子标记辅助选择中可以考虑优先使用。     

葡萄二倍体与四倍体品种间杂交胚挽救取样时期的确定

 通过系统测定葡萄二倍体与四倍体品种间杂交胚珠的重量变化和解剖观察胚珠的发育情况，判断其败育发生时期和发生方式，并进一步通过胚珠培养试验确定取样时期。与无核品种不同，大多数有核品种与倍性不同的品种杂交后，胚珠的败育存在个体间差异。胚珠发生败育的时期与母本品种的成熟期相关，早熟品种从花后第5周开始出现败育胚珠，中熟品种开始败育时期比早熟品种晚1周，晚熟品种花后9周才开始败育。胚挽救的取样时期可以根据母本品种成熟期确定，早熟品种为授粉后6～9周，中熟品种为授粉后7～10周，晚熟品种为授粉后9～12周。     

陆地棉高密度遗传图谱的构建及产量相关性状的QTL定位

【目的】通过构建高密度SNP遗传图谱，开展棉花多群体产量相关性状的QTL定位，获得稳定性好、精确度高的QTL，为产量性状调控基因的挖掘和有效分子标记的开发提供依据。【方法】以高稳产冀丰1271为母本、优质自交系冀丰173为父本，构建包含200个单株的F₂群体，利用测序基因分型(genotyping by sequencing,GBS)技术开发群体的SNP标记并构建高密度遗传图谱，对F₂、F_2:3、F_2:4群体的衣分、子指和单铃重进行QTL定位，注释主效和稳定QTL位点内的基因并分析基因在不同组织的表达模式，筛选候选基因。【结果】通过简化基因组测序，共获得383.07 Gb数据，包括母本冀丰1271的26.93 Gb、父本冀丰173的27.30 Gb和F₂群体的328.84 Gb,Q30值分别为90.55%、89.95%和95.77%。在F₂群体中开发了1 305 642个SNP标记，其中，用于构建遗传图谱的aa?bb型SNP为410 726个。构建了一张包...     

5个无核葡萄品种在吐鲁番地区的栽培性状及制干特性分析

【目的】分析5个无核葡萄品种在吐鲁番地区的栽培性状、果实品质及制干特性差异，为新无核葡萄品种的推广利用和产区品种结构优化提供参考。【方法】以吐鲁番地区目前主栽(无核白)及新引入或推广(长粒无核白、无核白鸡心、波尔莱特、紫甜无核)的5个无核葡萄品种为试材，在露地栽培条件下，系统研究比较5个无核葡萄品种物候期、生长结果习性、果实品质及制干特性差异，利用主成分分析法评价各品种葡萄、葡萄干综合品质。【结果】5个无核葡萄品种在物候期、生长结果习性、果实品质及制干特性方面存在明显差异。无核白、长粒无核白、无核白鸡心熟性表现为中熟，紫甜无核中晚熟，波尔莱特晚熟；无核白鸡心、紫甜无核结果枝率均在65.00%以上，但无核白鸡心萌芽率仅53.70%;无核白平均单株产量超过35.00 kg,无核白鸡心仅14.28 kg;无核白鸡心、紫甜无核果粒质量均超过6.00 g,无核白仅3.79 g;紫甜无核葡萄可溶性固形物含量仅19.66%,而其他品种均超过21%;波尔莱特可滴定酸含量为0.65%,紫甜无核仅0.34%;无核白鸡心和紫甜无核分别具有淡玫瑰香味和淡牛奶香味；葡萄综合品质排序为紫甜无核>无核白鸡心&...     

无核葡萄胚挽救技术研究

[目的]研究无核葡萄胚挽救过程中的一些主要影响因素,为今后开展无核葡萄胚挽救育种提供参考。[方法]以6个无核葡萄杂交及自交组合未成熟胚珠为试材,研究了接种时期、培养基及激素浓度对无核葡萄胚挽救效果的影响。[结果]各组合适宜的胚珠接种时期为：火星无核×无核白鸡心在花后40d,金星无核×康能无核在花后55d,优无核×布朗无核在花后45d;采用ER为基本培养基更有利于胚珠的发育和萌发;不同品种的胚珠对培养基中IBA浓度要求不同,幼胚发育程度较高,败育时期较晚的胚珠,适合较低的IBA浓度,胚发育程度较低,败育较早的胚珠则需要较高的IBA浓度。[结论]接种时期、培养基种类和培养条件对无核葡萄胚挽救的成功都非常重要,且各条件的确立要视具体品种而定。     

棉籽大小与形状关联标记发掘及候选基因筛选

棉籽在油脂、饲料加工等领域具有重要用途,且影响纤维产量和品质。为发掘棉籽性状遗传位点与候选基因,利用419份具有丰富遗传变异的棉花品种资源构成的自然群体,在2个年度鉴定其棉籽性状,结合群体重测序SNP基因型进行全基因组关联分析。结果发现,供试群体棉籽长度、宽度、长宽比、面积与周长等性状存在较大遗传变异,变异系数3.91%~9.55%;有7个SNPs在2年同时被检测到与棉籽大小和形状关联,有23个SNPs在1年与3个以上棉籽相关性状关联,其中D11染色体D11∶50561153在2年与粒宽、面积和周长关联,D12染色体D12：56031535在2年与粒长、面积和周长关联;同时,D05染色体在2年检测到4个与籽粒长宽比显著关联SNPs,A07染色体检测到10个与粒长、周长和面积关联SNPs,且单倍型间相关性状差异极显著。进一步分析发现,关联位点附近存在21个候选基因随棉花胚珠发育进程表达量呈现增加趋势,其中Gh_D05G0148编码乙烯调控反应的EBF蛋白（EIN3-binding F-box protein）,该基因在棉花开花后1~35 d的胚珠中优势表达,且以开花后10 d表达量最高;同时,候选基因Gh_D05G0144编码胚珠发育相关YABBY转录因子,该基因在棉花开花后20~35 d的胚珠中表达量较高,推测与棉籽后期发育有关。以上结果为棉籽多性状同步改良提供了选择标记与基因,为实现纤维和棉籽性状同步遗传改良奠定了基础。     

葡萄无核性状的SSR新分子标记开发及应用

【目的】开发葡萄无核性状的SSR新分子标记,对葡萄杂种后代进行早期无核性状鉴定,为分子标记辅助育种奠定基础。【方法】对母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’及F₁代杂交群体的133份葡萄材料进行RAD-seq,将测序结果比对到参考基因组上;运用SAMtools软件生成CaSFS软件所需的pileup和glf文件,过滤获得亲本之间的有效SNP集;采用窗口滑动的方法,确定每个窗口的基因型,选择以每15个SNP为一个窗口,每次滑动一个SNP,得到每个个体的基因型并生成bin图;对生成的bin图采用拟测交的方式利用Joinmap软件进行连锁分析,构建‘红地球’与‘森田尼无核’遗传连锁图谱;用WindowQTLCartographer2.0软件进行QTL定位,在定位区间通过Perl程序语言找到符合SSR特征序列的35个SSR分子标记,用Primer premier5.0软件设计35个SSR分子标记引物对,通过HRM技术筛选亲本之间在无核性状上存在差异的SSR分子标记,并在131株F₁代杂交群体及65个葡萄品种的自然群体中检测无核分型正确率、无核检测率、无核保持率。【结果】在‘红地球’与‘森田尼无核’构建的遗传连锁图谱上,将葡萄无核性状定位在chr18号染色体上,定位区间26 835 846-26 960 426,对无核的贡献率为77.9%,LOD阈值为26.3。亲本之间在无核性状上存在差异的SSR分子标记为VvSD10,其在111 bp等位点能对葡萄无核性状进行鉴定,利用分子标记VvSD10上的111 bp等位点通过HRM技术在葡萄F₁代杂交群体及自然群体中进行葡萄无核性状的鉴定。结果表明,分子标记VvSD10在F₁代杂交群体及自然群体中的无核分型正确率分别为97%、94%,其无核检测率均为56%,无核保持率分别为77%、85%。【结论】分子标记VvSD10在遗传群体及自然群体中的无核分型均能提供较高的准确信息,为无核葡萄的分子标记辅助育种奠定了基础。     

Identification of candidate genes related to soluble sugar contents in soybean seeds using multiple genetic analyses

Soluble sugar content in seeds is an important quality trait of soybean. In this study, 57 quantitative trait loci(QTLs) related to soluble sugar contents in soybean seeds were collected from databases and published papers. After meta-overview-collinearity integrated analysis to refine QTL intervals, eight consensus QTLs were identified. To further verify the consensus QTLs, a population of chromosome segment substitution lines(CSSLs) was analyzed. Two lines containing fragments covering the reg...     

葡萄SVP类MADS-box基因的克隆及表达分析

从无核白葡萄(Vitis vinifera cv.Thompson seedless)中克隆获得一个胚珠发育相关MADS-box基因。该基因cDNA全长1 248bp,ORF为729bp,编码一个含有243个氨基酸的蛋白。氨基酸多序列比对和系统发育分析显示,该基因属于SVP类MADS-box基因。采用半定量技术进行表达分析表明,该基因在葡萄的根、茎、叶、花蕾、盛花和胚珠中均有表达,但是有强弱差异。实时定量PCR技术分析表明在无核葡萄品种无核白胚珠发育过程中基因表达量先升后降,而在有核葡萄品种黑比诺胚珠发育过程中表达量一直呈下降趋势。     

葡萄无核基因的研究进展

综述了无核葡萄的类型与无核基因的利用,利用葡萄无核基因选育无核葡萄的技术,葡萄无核基因的遗传模型,无核基因的分子标记以及相关基因的克隆等研究进展。     

利用分子标记对无核抗病葡萄杂交后代的辅助选择

利用葡萄无核基因SCAR标记GSLP1-569,葡萄抗黑痘病基因RAPD标记OPS03-1354和抗霜霉病基因RAPD标记S416-1224,对欧洲葡萄无核品种×中国野生葡萄、无核品种自交共6个组合的127株胚挽救苗进行了无核、抗病的分子标记辅助选择。结果表明,在127株胚挽救苗中,检测出拥有无核基因SCAR标记GSLP1-569的杂种27株,其中4株杂种同时拥有无核基因SCAR标记GSLP1-569和抗黑痘病基因RAPD标记OPS03-1354;拥有抗黑痘病基因RAPD标记OPS03-1354的杂种28株,拥有抗霜霉病基因RAPD标记S416-1224的杂种19株,其中10株杂种同时拥有OPS03-1354和S416-1224。获得的无核、抗病葡萄杂种将为进一步选育出新品系奠定基础。     

葡萄胚珠发育及败育过程中果实主要营养成分变化

[目的]探明无核葡萄胚挽救的最佳培养条件。[方法]以无核品种无核白鸡心和有核品种维多利亚为试材,研究葡萄胚珠发育及败育过程中果实主要营养成分含量的变化。[结果]有核品种果实内可溶性糖、K、Mg含量高于无核品种,而Mn、Fe含量则相反,无核品种的含量高于有核品种。[结论]该研究为提高无核葡萄胚挽救成功率提供理论依据。