吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007的发酵条件及其对杨树溃疡病的防治效果

本文研究了拮抗细菌吡咯伯克霍尔德氏菌Burkholderia pyrrocinia菌株JK-SH007产抗菌物质的最佳发酵条件及其对杨树溃疡病的野外防治效果。结果表明,牛肉膏、蛋白胨是发酵培养基中最佳营养物质,有利于菌株JK-SH007抗菌物质的产生;培养基初始pH、培养时间、温度、培养体积、不同牛肉膏、蛋白胨组合等对菌株生长及其抗菌物质的产生有明显的影响,初始pH7、牛肉膏2g、蛋白胨20g、以1/2装液量装液、30℃振荡培养36h可获得较高产量的胞外分泌型抗菌物质;菌株JK-SH007的发酵液对杨树溃疡病的野外防效可达40.54%。     

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007产嗜铁素的相关基因克隆及条件优化

为了明确吡咯伯克霍尔德氏菌Burkholderia Pyrrocinia JK-SH007是否产嗜铁素,揭示其生防机制,本文通过CAS检测该菌株产嗜铁素的能力,并对其嗜铁素合成相关基因cepR进行克隆及序列分析,同时采用单因素试验及响应面法对菌株JK-SH007产嗜铁素条件进行优化。结果表明,菌株JK-SH007具有明显的产嗜铁素能力,其嗜铁素合成相关基因cepR大小为720 bp,与B.pyrrocinia（EU034001）的亲缘关系最近,同源性为99%,两者序列相似性为97%,13个位点出现SNP;另外菌株JK-SH007 cepR基因编码的氨基酸序列有3个氨基酸发生了替换,两者一致性为97%。该菌产嗜铁素最优培养时间是15 h、pH 8、转速200 r/min、最佳碳源和氮源分别是甘油和氯化铵;PB试验筛选出影响该菌株产嗜铁素的关键性因素分别是pH、加碳量、加氮量;CCD试验结果显示,pH和加氮量的交互作用较明显;最终采用Design-Expert软件分析出菌株JK-SH007产嗜铁素最佳方案为碳源加入量15.00 g/L、氮源加入量10.50 g/L、温度30℃、pH 7.36,优化后菌株产嗜铁素能力由18.59提升到37.86,响应面优化产嗜铁素条件的效果是显著的,嗜铁素产量得到明显提高。     

棉花根系分泌物对枯草芽胞杆菌NCD-2生物膜形成和根际定殖的影响

 为明确棉花根系分泌物对生防枯草芽胞杆菌NCD-2生物膜形成的影响,本研究首先比较了菌株NCD-2在不同棉花品种(冀棉11、中棉所41、中植棉2号、鲁棉29和海岛棉Pima90)根际的定殖能力。结果表明,菌株NCD-2在Pima90的根际定殖能力最强,播种35 d后在根际的群体数量达到7.63×10⁵ CFU·g^-1根重;而在中植棉2号的根际定殖能力最弱,播种35 d后根际菌株NCD-2的群体数量为6.51×10⁴ CFU·g^-1根重。通过再循环水培系统收集根系分泌物的方法获得了不同棉花品种的根系分泌物,测定了其对菌株NCD-2生物膜形成的影响。结果表明,海岛棉Pima90的根系分泌物对该菌株生物膜形成的促进作用最强,而中植棉2号的根系分泌物对菌株NCD-2生物膜形成影响最弱。进一步分析了棉花根系分泌物中6种糖分和13种氨基酸对菌株NCD-2生物膜形成的影响,结果发现,葡聚糖和脯氨酸显著促进了该菌株的生物膜形成。     

ywbB基因对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株生物膜形成和根际定殖能力的影响

为明确枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis NCD-2菌株生物膜形成相关基因及其在生物膜形成、根际定殖中的作用,采用转座子插入技术,从4000余株NCD-2突变子中获得6株生物膜形成能力降低的突变子。在生物膜形成能力丧失的突变子M3中,转座子以单拷贝的形式插入到ywbB基因内部。通过基因同源重组技术对ywbB基因进行缺失突变,获得ywbB基因缺失突变菌株NCD-2(ΔywbB),与野生菌株相比,突变子丧失了生物膜形成能力。进一步比较发现,突变菌株NCD-2(ΔywbB)显著降低了在棉花根际的群体数量,同时也降低了对棉花立枯病的防治效果。研究证明,ywbB是NCD-2菌株生物膜形成途径中的重要基因,且生物膜形成与NCD-2菌株根际定殖和生防效果呈正相关。     

哈密瓜细菌性果斑病菌群体感应系统的检测

本文利用群体感应信号报告菌Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4),在LB报告平板上对燕麦食酸菌西瓜亚种的19个菌株进行了初步检测,发现18个菌株有群体感应信号产生.用琼脂条法对菌株Pslb-94进一步检测,证实菌株Pslb-94存在群体感应系统.提取了该菌株信号物质,反相薄层层析(TLC)检测证明该菌株能产生群体感应信号分子.     

植物内生细菌在辣椒体内的定殖动态及对辣椒疫病的防治效果

为了探讨具生防作用的植物内生细菌在辣椒体内的定殖动态与其防治辣椒疫病的关系,采用对峙培养法和盆栽苗防效法筛选生防菌株,依据菌体形态、生理生化性质和16SrDNA序列鉴定菌种,用抗利福平标记研究菌株在辣椒苗中的定殖动态,在同时接入植物内生细菌和灌根接种辣椒疫霉菌的条件下分析生防菌株的定殖数量与防效的关系。结果表明,菌株G9、R15和J13对辣椒疫病防效最好,经鉴定均为荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens。菌株G9和R15在辣椒根部定殖量高于菌株J13;定殖周期均在30-40d,呈“先增后减”的变化趋势;菌株G9和R15在接种第15d时定殖量最高,菌株J13在根、茎和叶中定殖量达到最高的天数分别为第9、15和15-20d,定殖数量的变化为根〉茎〉叶。菌株G9定殖量达到9．73×10^5cfu·g-1时辣椒疫病的防效达到100％,保持该数量的时间约6d;菌株R15定殖量达到6．30×10^5cfu·g-1以上时对辣椒疫病的防效达到100％,保持该数量的时间约14d。研究结果展现了植物内生细菌在辣椒疫病生物防治上的应用潜力,为制定植物内生细菌防治辣椒疫病的施用技术提供了科学依据。     

茶树内生菌株TL2对茶轮斑病防治效果的研究

从茶树上分离筛选到14株能在茶树体内内生、对茶叶斑病菌拮抗作用较强的芽孢杆菌菌株。14株目标菌株都具有在茶树体内内生定殖的能力,对茶叶斑病菌及其它植物病原菌有一定的拮抗能力。其中,菌株TL2具有较强的内生定殖能力、拮抗能力强且拮抗谱广,对茶轮斑病防病效果强。     

荧光假单胞菌2P24调控基因突变体定殖能力和生防效果分析

在温室盆栽条件下,研究了分离自小麦全蚀病自然衰退土壤、可防治多种土传病害的荧光假单胞杆菌2P24菌株的2,4-二乙酰基间苯三酚合成基因突变体、GacS/GacA双因子调控系统突变体,以及PcoR-PcoI群体感应系统的突变体菌株在植物根围定殖能力和防病效果。结果表明,2,4-二乙酰基间苯三酚生物合成突变体不影响菌株在植物根部的定殖;GacS/GacA双因子调控系统中任一因子的突变菌株和pcoI^-突变菌株显著降低了菌株在植物根部的定殖能力。温室病害防治试验结果表明,与野生菌2P24相比,phlD^-,gacS^-,gacA^-,pcoI^-突变体对小麦全蚀病和番茄青枯病生防效果均显著降低;而相应的互补菌株生防效果恢复到野生型的水平。结合前期工作结果,我们推测GacS/GacA双因子调控系统和QS系统在2P24菌株定殖和防病过程的信号传递上形成级联途径。     

内生解淀粉芽孢杆菌CC09菌株在小麦叶部的定殖能力及其防治白粉病效果研究

利用抗利福平标记及平板菌落计数法,研究了内生解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens CC09在小麦叶内和叶际的定殖能力,证明菌株CC09能够在小麦叶内和叶际以较高数量稳定定殖,叶际定殖量在喷雾后1 d达到最大(3.98×107 cfu/g),之后稳定维持在1.58×104~3.16×105 cfu/g;而叶内的定殖量7 d时达到最大(1.58×106 cfu/g)并维持稳定。另外,菌株CC09在小麦叶际和叶内的定殖受温度及其代谢产物的影响,温度越高,其叶际和叶内定殖量越高;菌体重悬液中添加相当于原发酵液中代谢产物含量1倍和4倍的浸膏能显著提高菌株CC09在小麦叶际和叶内的定殖;而接种量对菌株CC09的定殖无显著影响。琼脂培养法测定表明,菌株CC09发酵液及其无菌滤液对小麦白粉菌分生孢子萌发均有显著的抑制作用,导致孢子透明、变形甚至细胞破裂。室内盆栽试验表明,菌株CC09发酵液对小麦白粉病有很高的预防和治疗效果,15 d时防效为95%,是三唑酮的2.3倍,而其20倍稀释液的防效与化学农药三唑酮效果相当。以上研究结果表明菌株CC09是防治小麦白粉病的潜在生防菌株,具有良好的开发和应用价值。     

茄子黄萎病生防内生细菌的筛选、鉴定及胞外抗菌物质的特性

对分离筛选获得的6株对茄子黄萎病菌Verticillium dahliae具有强拮抗活性的内生细菌进行盆钵防效测定,其中3个菌株29-122、2-5和0-21对茄子黄萎病防治效果均在80%以上。对菌株29-12和22-5进行内生定殖能力检测,发现菌株29-12在茄子体内定殖时间更长。经鉴定,菌株29-12为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。菌株29-12能产生抗茄子黄萎病菌的胞外活性物质。该活性物质对热较稳定;pH6.0~9.0时活性稳定,pH<4.0时没有活性;对蛋白酶K和胰蛋白酶都不敏感。抑菌谱测定表明,该物质对10种病原真菌均有较强的抑制作用。     

海洋细菌解淀粉芽胞杆菌SH-27在大豆体内的定殖动态及促生防病作用

为明确海洋细菌SH-27在大豆体内的定殖动态及其促生长作用和对大豆疫病的防治效果,本研究采用抗利福平标记法和平板对峙生长法,筛选对利福平标记稳定且对大豆疫霉菌具有较好抑菌作用的标记菌株SH-27^Rif,培养10代后的标记菌株SH-27^Rif能够保持稳定,对大豆疫霉抑制率为56.92%。分别采用灌根和涂叶法研究其在大豆体内的定殖动态,灌根与涂叶法均可使标记菌株SH-27^Rif在大豆体内定殖,时间达31 d以上;灌根处理定殖量呈先升后降趋势,定殖量根 > 茎 > 叶,处理后第21 d根部定殖量达到最大（6.6×10⁵ cfu/g）;涂叶处理第1 d大豆叶片定殖量达到最大（6.3×10⁵ cfu/g）,随后呈迅速下降趋势;定殖量叶>茎,根部未检测到标记菌株SH-27^Rif。盆栽促生试验结果表明,菌株SH-27发酵液灌根处理第15 d,处理组株高、根长、茎粗、鲜重、干重、叶绿素含量、根系活力等指标均显著高于对照组。盆栽防病试验结果表明：菌株SH-27发酵液灌根处理能显著降低大豆疫病的病情指数,对大豆疫病3、5、7和9 d的防效分别为83.44%、66.34%、57.18%和52.85%。以上研究结果表明海洋细菌SH-27是防治大豆疫病的潜在生防菌株,具有良好的开发和应用价值。     

L-脯氨酸对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株生物膜形成的影响

 枯草芽胞杆菌 NCD-2菌株在棉花品种‘冀棉11'根际的定殖能力与其根系分泌物中的L-脯氨酸相关。本研究通过外源添加L-脯氨酸评价其对NCD-2菌株生长量和生物膜形成的影响。结果表明,在MSgg培养基中添加L-脯氨酸培养48 h后对菌株生长不存在显著影响。采用称重法测定生物膜的湿重和干重,结果表明在MSgg培养基添加L-脯氨酸显著增加了生物膜产量,且生物膜的褶皱程度和立体结构变得更为明显。采用结晶紫染色法进行生物膜的定量测定发现,浓度为1.250～10.000 mg·mL^-1的L-脯氨酸可以显著提高菌株生物膜形成能力,而低浓度0.625 mg·mL^-1 的L-脯氨酸对生物膜形成无影响。通过RT-qPCR检测了NCD-2菌株生物膜形成相关基因tasA和epsA表达量的变化,结果表明,添加上述不同浓度L-脯氨酸能够显著提高tasA基因表达量,提高了2.53~9.98倍。除了浓度为0.625 mg·mL^-1 L-脯氨酸可提高epsA基因表达外,其他浓度没有显著改变epsA基因的表达,而且epsA基因表达量低于tasA基因。综合分析表明,L-脯氨酸促进NCD-2菌株生物膜形成不是通过改变菌株生长量,而是诱导tasA基因的表达产生更多的胞外蛋白TasA。     

抑制黄瓜枯萎病的链霉菌S-101及其生防作用研究

为了获得抑制黄瓜枯萎病的高效生防菌,对青海湖附近植被根系土壤中的微生物进行分离筛选。测定拮抗菌的抑菌活性及其对黄瓜枯萎病的防控效果。本文通过平板对峙法分离筛选出一株生防链霉菌S-101,该菌株对供试的几种病原真菌都有较好的拮抗作用,其中对尖镰孢菌黄瓜专化型的抑制率为53.3%,对草莓炭疽菌的抑菌率为45.5%;并通过形态特征及16S rDNA序列分析对菌株S-101初步鉴定为Streptomyces luridus;盆栽试验结果表明,菌株S-101发酵液对黄瓜枯萎病的防治效果达57.11%;通过构建绿色荧光蛋白标记的基因工程菌S-101-GFP,检测了该菌株在黄瓜根部及根围土壤中的定殖能力,随着定殖天数的增加,数量由处理时的1×10⁸ cfu/g逐渐减少到1×10⁶ cfu/g,0～14 d下降较快,21～28 d下降较慢,28～35 d趋于稳定,孢子数维持在1×10⁶ cfu/g。因此,菌株S-101是防治黄瓜枯萎病的潜在生防菌株,具有开发成为微生物农药的应用价值。     

哈茨木霉T2-16的GFP标记及其生防特性

优化高效拮抗生防菌哈茨木霉T2-16的转化条件,筛选出与野生型菌株具有相似生防特性的阳性转化子,为生防木霉菌T2-16的定殖动态、分布规律等研究打下基础。通过PCR和分子克隆技术构建具有G418抗性基因的绿色荧光（GFP）表达载体pKN-sGFP,利用PEG-CaCl₂介导的原生质体转化法,获得强荧光表达的哈茨木霉T2-16转化子,并将其与野生型菌株的生物特性进行比较,筛选出与野生型菌株具有相似生防特性的阳性转化子。试验结果显示,哈茨木霉T2-16在20℃培养条件下对1000 μg/mL G418敏感,在上述优化条件下,转化获得稳定遗传的阳性转化子TG2-10;进一步比较其与野生型菌株的生物特性发现,两者之间无明显差异,可用于下一步哈茨木霉T2-16生防机理的研究。     

青枯雷尔氏菌Ⅲ型分泌系统hrcN基因的功能分析

hrcN是植物病原菌Ⅲ型分泌系统基因(T3SS)的结构基因之一,对病原菌的致病力有重要影响.本研究克隆青枯雷尔氏菌CBM613的hrcN基因并作生物信息学分析,结果显示该基因长度为1320bp,共编码439个氨基酸,预测HrcN蛋白无信号肽,无跨膜区域,整体呈弱亲水性,该蛋白为ATP酶,定位于细胞内膜和细胞质.基因敲除...     

枯草芽胞杆菌HMB19198在番茄叶片上定殖能力的分子检测

枯草芽胞杆菌HMB19198能有效防治番茄灰霉病,为快速、准确检测HMB19198在叶面的定殖能力,本研究通过对HMB19198全基因组序列比对分析,获得该菌株102 bp功能未知的独有基因序列,设计出针对HMB19198的特异性引物和探针。荧光定量PCR结果表明,该引物和探针对HMB19198具有较高的特异性,在有番茄叶片DNA干扰下,体系检测阈值为10²拷贝/μL。利用荧光定量PCR技术和菌落计数法检测了HMB19198在叶片上定殖动态。叶片喷施1×10⁸ cfu/mL的菌体悬浮液,0 d后菌体数量分别为1.7×10⁸拷贝/g叶片和8.9×10⁷ cfu/g叶片,2、4、6和8 d后菌株HMB19198在叶面的定殖数量逐渐降低,8 d后定殖数量分别为1.0×10⁷拷贝/g叶片和1.2×10⁷cfu/g叶片。防效试验结果表明,喷施菌株HMB19198悬浮液2 d后防效在80%以上,8 d后防效降为37.9%。     

解淀粉芽胞杆菌Jt84防治水稻稻曲病田间应用技术研究

为了明确解淀粉芽胞杆菌Jt84防治水稻稻曲病田间应用技术,本文初步研究生防菌Jt84定殖规律以及不同喷施时期对水稻稻曲病的防效.结果显示:生防菌Jt84在水稻叶表能够有效定殖,7～16 d时,叶表定殖菌量维持在104cfu/cm2,30 d仍可在水稻叶表检测到生防菌Jt84;生防菌Jt84防治水稻稻曲病的最佳防治时期为...