不同年龄牦牛皮肤厚度变化研究

【目的】探讨牦牛皮肤随年龄增长的厚度变化规律.【方法】采集初生、半岁及成年牦牛皮肤样品,利用千分尺测量各部位皮肤厚度,采用常规石蜡切片技术,H.E染色和Masson’s三色染色方法,分别测量各部位皮肤表皮层、角质层、表皮非角质层及真皮层厚度,对所得数据进行统计学分析.【结果】牦牛躯体不同部位皮肤厚度存在差异,最厚的部位是颊部、颈腹侧及背部,最薄的部位是腹股沟及腋下.从背部到腹部、外侧面到内侧面皮肤厚度呈递减趋势.【结论】牦牛皮肤厚度随年龄增长呈增厚趋势,其中真皮层增厚趋势最明显,表皮层增厚趋势相对不明显.详细总结了牦牛皮肤厚度在不同躯体部位及不同年龄的变化规律,为更深入地研究牦牛皮肤的生长发育提供依据.     

关中奶山羊胎儿皮肤发育的组织形态观察

【目的】观察关中奶山羊胎儿皮肤及其衍生物在不同生长阶段的组织发育及生长变化。【方法】运用HE和Masson染色法以及透射电镜,对不同发育时期的山羊胎儿皮肤组织切片进行染色和观察。【结果】表皮于8~9周龄开始发育;10周龄表皮由3层细胞构成,真皮层出现胶原纤维,表明真皮层开始出现;在11周龄可见有原始毛囊出现,有少量张力原纤维存在,并发现朗格罕斯细胞;12~13周龄表皮细胞出现角化层、透明层及颗粒层的分化,可见汗腺;14~15周龄毛球上皮细胞索开始分化为外根鞘、内根鞘的原基和毛发的前体,在毛囊一旁出现皮脂腺,张力原纤维增多、变粗,并发现典型的桥粒结构;16~17周龄表皮层变薄,毛开始形成,并随着发育逐渐长出体表;18周龄皮肤结构渐趋成熟。【结论】山羊胎儿表皮的发生先于真皮发生,皮肤在胎儿期处于剧烈的分化阶段,皮肤衍生物的形成对皮肤的发生有重要作用。     

小型猪发情周期和妊娠早期外周血清孕酮含量测定

本试验测定了5头贵州香猪和5头版纳微型猪发情周期和妊娠早期外周血清的孕酮含量。这两个品种发情周期血清孕酮含量有相似的变化,峰值均出现在发情周期的 9～12天,贵州香猪为 26.00ng/ml,版纳微型猪为24.30ng/ml。在妊娠早期的变化也大致相同。香猪和版纳微型猪在妊娠-3～12天与发情周期-2～12天的孕酮含量变化相近,妊娠 12天峰值香猪为 21.40ng/ml,版纳微型猪为 27.80ng/ml;在妊娠12天后两品种猪孕酮含量略有下降;16～20天后又开始回升,并维持在较高水平。发情周期和妊娠早期外周血清孕酮含量16天后有明显差异（P<0.01）,可供早期妊娠诊断参考。     

版纳微型猪近交系STRA8基因克隆及功能生物信息学分析

【目的】以版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line, BMI)为材料,初步研究STRA8基因的功能,为该基因在猪精子形成过程的作用研究奠定基础。【方法】以GenBank下载的猪STRA8基因序列JQ965783及多条猪EST序列为参考序列,设计特异性引物扩增版纳微型猪近交系(BMI) STRA8基因。对STRA8蛋白质进行理化特性和功能生物信息学分析,包括二级结构、蛋白功能域、疏水性、跨膜结构、信号肽、亚细胞定位、磷酸化位点以及蛋白质功能分析;搜索并下载其他物种的STRA8蛋白质序列构建多物种系统进化树。应用实时荧光定量PCR技术检测BMI STRA8在版纳微型猪近交系15个组织中的mRNA转录表达水平。【结果】获得了包含编码序列1 101 bp的全长序列1 316 bp,编码366个氨基酸,序列已提交GenBank,基因登录号KU705622,蛋白质分子量(Mw) 41.06 ku,等电点(pI) 4.52。STRA8二级结构中α螺旋含量最高,占52.19%;含有1个蛋白功能域;在氨基端有1个HLH结构域和1个卷曲螺旋区域,在羧基端有2个低复杂度区域;疏水性结果表明STRA8基因N末端、C末端均亲水;无跨膜结构,无信号肽序列;该蛋白质位于细胞核中的概率是56.5%;STRA8蛋白共有34个磷酸化位点;系统进化结果表明:BMI与羊、水牛的相似度最高。STRA8基因mRNA在检测的BMI 15个组织中呈现差异表达现象,睾丸中表达量最高。【结论】结果将为进一步研究STRA8基因在猪精子发生方面的作用及功能提供参考。     

版纳微型猪近交系FANK1基因CDS克隆、qPCR表达及功能生物信息学分析

【目的】获得猪FANK1基因CDS序列、组织表达和蛋白质功能信息。【方法】以GenBank下载的猪及近缘物种的FANK1 mRNA序列为参考序列,设计特异引物从版纳微型猪近交系(BMI)睾丸组织中扩增FANK1基因完全编码序列及部分侧翼序列。应用实时荧光定量PCR技术检测BMI 15个重要组织的FANK1 mRNA转录表达水平,并对FANK1翻译的蛋白质序列进行多种功能生物信息学分析,预测FANK1蛋白质的功能,最后构建FANK1多物种氨基酸系统进化树。【结果】获得了BMI FANK1编码区序列长1 041 bp,编码346个氨基酸,序列已提交GenBank,基因登录号为KU705617和KU705618,对应的氨基酸登录号为AOC89035和AOC89036。基因组结构分析表明FANK1基因定位于猪14号染色体,有11个外显子和10个内含子。多组织相对荧光定量表达分析表明FANK1基因在睾丸、尿道球腺和精囊腺中呈高表达水平;在其他组织中呈中低表达水平。功能生物信息学分析表明FANK1蛋白质含有2种保守结构域FN3和ANK,无跨膜螺旋结构,无N端信号肽序列,二级结构以无规卷曲为主,N末端和C末端均亲水,有4类功能活性位点。系统进化分析表明,FANK1基因在进化中高度保守,且与牛、羊的亲缘关系最近,符合物种的系统分类学。【结论】成功克隆了版纳微型猪近交系FANK1基因的CDS序列并进行了多种组织表达分析,为后续研究FANK1基因在小型猪精细胞分裂及调节信号通路方面的作用及功能奠定基础。     

两种毛色牦牛皮肤黑色素组织学分析

【目的】观察两种不同毛色的牦牛皮肤中黑色素分布。【方法】采用冰冻切片和石蜡切片技术,用甲苯胺蓝和HE染色进行组织学分析。【结果】两种切片方法均能展现毛囊结构、皮肤组织分层结构。甲苯胺蓝染色:石蜡切片比冰冻切片着色较浅,易观察到黑色素的分布;冰冻切片通过显微镜观察发现牦牛毛囊由毛鞘、毛乳头和毛球外围的结缔组织形成。HE染色:冰冻切片着色较深,皮肤结构层次分明;石蜡切片着色均匀,细胞分布明显。【结论】天祝白牦牛表皮的基底层和毛囊周围发现分布着少量的黑色素。大通牦牛的毛囊和表皮中均发现有大量黑色素的存在。大通牦牛毛囊中与毛发相连毛乳头附近的黑色素含量比毛囊周围其他部位含量高,皮肤表皮基底层相对毛囊黑色素含量少。大通牦牛毛囊周围黑色素比天祝白牦牛密集,且更为明显。大通牦牛的毛囊群比天祝牦牛毛囊群密集,毛囊的直径比天祝牦牛的长,毛发较粗。石蜡切片的HE染色是比较好的方法。     

版纳微型猪近交系B4GALNT2基因真核表达载体构建及亚细胞定位分析

【目的】研究异种器官移植免疫排斥相关基因B4GALNT2的亚细胞定位情况。【方法】以版纳微型猪近交系(BMI)为试验对象,通过RT-PCR方法获得B4GALNT2基因cDNA序列,运用分子克隆技术构建B4GALNT2和报告基因EGFP的重组真核表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,将其转染猪肾上皮细胞PK15进行瞬时表达,同时用Mito Tracker和Hoechst33342荧光染料分别对线粒体和细胞核染色,通过EGFP示踪检测B4GALNT2在PK15细胞中的表达和定位。【结果】成功构建了BMI B4GALNT2基因的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,转染PK15细胞后主要在细胞质中检测到绿色荧光蛋白的表达,试验结果与PSORTⅡserver网站的预测一致。【结论】B4GALNT2蛋白主要定位于细胞质,揭示该蛋白主要在细胞质中发挥其功能作用。     

猪源SLPI对小鼠皮肤损伤愈合的效果

【目的】探究猪源分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(Secretory Leukocyte Protease Inhibitor, SLPI)对皮肤创伤愈合过程中的治疗效果,以开发其潜在的使用价值。【方法】使用重组表达的猪源SLPI处理小鼠创伤,筛选蛋白的最佳作用浓度,再以此浓度探索其抗损伤愈合情况。设置创伤组、SLPI处理组及阳性药对照组(阳性药物为百灵金方抑菌液),观察不同时间大体病理变化与显微病理变化,对创伤愈合进行临床评分,来评判SLPI对伤口恢复的影响作用。【结果】结果显示,SLPI最佳作用浓度为0.25 mg/mL。三组小鼠创伤溃疡面随时间延长均逐渐减小;与创伤组相比,从第3天开始,SLPI处理组病理打分均低于创伤组(P<0.05或P<0.01),而与阳性药组表现接近(P<0.05);在第7天,阳性药组和SLPI组均可观察到毛囊生长,但创伤组变化不明显。显微病理变化显示,SLPI组和阳性药组在第5天可观察到表皮层和皮脂腺,在第7天成纤维细胞数量明显较多,炎性细胞浸润减少。【结论】重组表达的猪源SLPI对小鼠皮肤创伤愈合有一定效果,为开发针对猪体皮肤损伤有效药物提供...     

版纳微型猪近交系AO血型基因外显子7 和外显子8遗传特征分析

猪的UDP-N-乙酰半乳糖胺转移酶(UDP-N-acetylgalactosamine transferase,UDP-Gal NAc)是负责转移一分子的N-乙酰-D-半乳糖胺基(NAc Ga1)到H底物上形成A抗原,从而决定A型血的转移酶,AO血型系统的A基因编码A转移酶。采用PCR技术和直接测序的方法对版纳微型猪近交系UDP-Gal NAc基因外显子7和外显子8进行多态性分析,均仅检测到1种基因型。通过序列比较发现,版纳微型猪近交系UDP-Gal NAc基因外显子7和外显子8与NCBI数据库中14个其他物种的ABO血型基因存在较高的同源性。与人相比,猪外显子7第92~97位缺失编码两个氨基酸的6个碱基。构建的基因进化树分析结果显示版纳微型猪近交系与牛、羊、鲸亲缘关系最近。     

华南地区副猪嗜血杆菌的耐药性特点及四环素耐药基因携带情况

 【目的】副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是危害世界养猪业的重要细菌性病原菌之一,了解副猪嗜血杆菌临床分离株的耐药性特点和四环素耐药基因的携带情况,为临床上该病的防控提供科学依据。【方法】参考CLSI推荐的肉汤微量稀释法检测副猪嗜血杆菌华南分离株对21种抗菌药物的耐药性,用PCR方法检测9 种四环素耐药基因的携带情况,并利用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型技术对携带四环素耐药基因的菌株进行了遗传相关性分析。【结果】结果显示：被检菌株对磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类抗菌药物表现较强的耐药性,尤其对磺胺类药物的耐药率高于80%;对头孢菌素类药物比较敏感;菌株都耐受3种或3种以上的抗菌药物,其中以7重和8重耐药菌株的数量最多,分别占19.13%和17.39%。2008-2010年华南地区副猪嗜血杆菌的耐药性总体上呈现逐年上升的趋势。15.62%（18/115）的菌株携带tetB基因,这些菌株之间表现明显的遗传差异性,但是部分菌株存在克隆传播关系。【结论】副猪嗜血杆菌对抗菌药物的耐药性比较高,tetB基因在耐四环素的副猪嗜血杆菌中广泛存在,表明主动外排泵作用可能是副猪嗜血杆菌对四环素产生耐药性的主要机制。本研究有助于了解副猪嗜血杆菌耐药性的变化特点,并初步揭示了该菌对四环素的耐药机理。     

苯并咪唑氨基甲酸酯类药物抗猪囊尾蚴的作用靶点

 【目的】研究苯并咪唑氨基甲酸酯类抗囊药物对猪带绦虫囊尾蚴的作用靶点，为药物的类型衍化和新药开发提供理论依据。【方法】测定体外培养的和猪体内的囊尾蚴于阿苯哒唑和奥芬哒唑分别作用后能量代谢途径物质含量及其关键酶活性变化。【结果】阿苯哒唑和奥芬哒唑对体外培养猪六钩蚴、未成熟期和成熟期猪囊尾蚴，以及体内发育未成熟期和成熟期猪囊尾蚴的糖无氧分解途径、丙酮酸羧化支路与逆向三羧酸循环途径均有一定程度抑制作用，代偿性促进糖异生及蛋白质、脂类和核酸分解途径，葡萄糖吸收受阻。阿苯哒唑和奥芬哒唑体外非竞争性抑制延胡索酸还原酶复合体活性。【结论】并咪唑氨基甲酸酯类抗囊药物非竞争性抑制猪囊尾蚴FR复合体活性，抑制葡萄糖的摄取。     

猪雄性增强抗原1基因MEA1编码区克隆、表达及生物信息学分析

【目的】克隆猪MEA1基因编码区序列,获得基因表达谱并了解其蛋白质的基本功能。【方法】从GenBank下载猪及近缘物种MEA1序列作为参考序列,设计特异引物从版纳微型猪近交系(BMI)睾丸组织中扩增MEA1基因完全编码序列及部分侧翼序列,对MEA1翻译的蛋白质序列进行多种功能生物信息学分析并构建多物种系统进化树,最后用实时荧光定量PCR技术检测BMI 15个重要组织的MEA1 mRNA转录表达水平。【结果】扩增得到BMI MEA1编码区序列长525 bp,编码174个氨基酸。功能生物信息学分析表明:MEA1含有1个完整的保守结构域,无跨膜螺旋结构,无N端信号肽序列,二级结构以无规卷曲为主,N末端疏水,C末端均亲水,有3类功能活性位点。系统进化分析表明:MEA1基因在进化中高度保守,且与人、长臂猿的亲缘关系最近,符合物种的系统分类地位。多组织相对荧光定量表达分析表明:MEA1基因在睾丸中高表达,在心、肝等其他14个组织中低表达。【结论】为探索BMI MEA1基因在睾丸形成和精子发生过程中的作用及功能奠定基础。     

猪-人异种移植相关基因CMAH的克隆、表达及功能生物信息学分析

【目的】研究版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line,BMI)CMAH基因特性,探索该基因在猪-人异种器官移植免疫排斥中的作用。【方法】采用实时荧光定量PCR技术检测BMI 27个重要组织的CMAH m RNA表达水平,采用Western blot检测BMI在9个组织中的CMAH蛋白表达特征,并对CMAH编码的氨基酸进行生物信息学预测,分析CMAH蛋白质的功能。【结果】扩增得到BMI CMAH编码区序列长1 734 bp,编码577个氨基酸,序列已提交Gen Bank,基因登录号KM098147,对应的氨基酸登录号AIS36193。多组织相对荧光定量表达分析表明CMAH基因在颌下腺、脾及舌下腺中呈相对高表达水平,在其他组织中呈相对中、低表达水平。Western Blot分析表明CMAH蛋白在除脊髓和大脑外的其他组织都有表达。功能生物信息学分析表明CMAH蛋白质包含Rieske和Ula G保守结构域,二级结构以α螺旋为主,N末端亲水,C末端疏水,有6类功能活性位点。【结论】明确了CMAH基因的结构以及在多种组织中差异化表达情况,为深入研究其在异种器官移植方面的功能积累了基础资料。     

大通牦牛皮肤发育规律的研究

[目的]探讨大通牦牛的皮肤发育规律。[方法]采用组织学方法对4个年龄段（1、30、180日龄和成年牦牛）大通牦牛的皮肤组织结构进行研究。[结果]4个年龄段大通牦牛的皮肤均表现为表皮薄、真皮特厚的特点,且真皮层内毛细血管较少,表皮层内含大量色素细胞;4个年龄段大通牦牛的全皮厚均表现为出生后至30日龄逐渐变厚、至180日龄时又变薄、至成年时又变厚的一种变化趋势。[结论]为深入了解大通牦牛皮肤适应高原恶劣环境的组织结构特点提供了理论依据。     

大通牦牛皮肤发育规律的研究

[目的]探讨大通牦牛的皮肤发育规律。[方法]采用组织学方法对4个年龄段（1日龄、30日龄、180日龄和成年牦牛）大通牦牛的皮肤组织结构进行研究。[结果]4个年龄段大通牦牛的皮肤均表现为表皮薄、真皮特厚的特点,且真皮层内毛细血管较少,表皮层内含大量色素细胞;4个年龄段大通牦牛的全皮厚均表现为出生后至30日龄逐渐变厚、至180日龄时又变薄、至成年时又变厚的一种变化趋势。[结论]为深入了解大通牦牛皮肤适应高原恶劣环境的组织结构特点提供了理论依据。     

版纳微型猪近交系CPN10克隆、亚细胞定位、组织表达和生物信息学分析

【目的】以版纳微型猪近交系(BMI)为材料克隆CPN10基因,从亚细胞、m RNA水平及生物信息学方面初步探索其结构及功能特性,为该基因在猪—人异种器官移植免疫排斥中的作用研究奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法获得CPN10基因c DNA序列,应用分子克隆技术构建目的基因和报告基因EGFP的重组真核表达载体pEGFP-C1-CPN10,将其转染猪肾细胞PK15进行瞬时表达,通过EGFP示踪CPN10在PK15细胞中的表达和定位。进一步应用荧光定量技术明确其mRNA的多组织表达特征。最后利用生物信息学分析CPN10蛋白质的结构特征。【结果】得到BMI CPN10 CDS 309 bp序列(GenBank登录号:KM098149),成功构建了BMI CPN10基因的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1-CPN10,转染PK15细胞且主要在细胞质中检测到绿色荧光蛋白表达。多组织荧光定量表达分析表明:BMI CPN10 mRNA在皮肤中具有最高表达量,在肝和肾上腺中的表达量较高,在其余各组织中呈中低度表达或几乎不表达。生物信息学分析表明:CPN10编码102个氨基酸,其蛋白分子量为10.93 ku,等电点为8.89,含1个CPN10保守结构域和5个磷酸化位点,二级结构以延伸链结构为主,无跨膜螺旋结构和信号肽。【结论】CPN10基因定位在细胞质中,在皮肤中高表达,该研究结果为进一步研究该基因在免疫排斥方面的功能奠定了理论基础。     

微型月季品种分类的花粉形态学

 【目的】明晰微型月季花粉形态特征与其品种分类关系。【方法】利用光学显微镜和扫描电子显微镜观察10个微型月季品种花粉形态特征,并根据花粉形状、瘤状纹饰密度、网眼密度和条纹密度等性状对不同微型月季品种进行聚类分析。【结果】（1）微型月季花粉具有3个萌发孔,极面观为三裂圆形;花粉外壁纹饰为瘤状雕纹、网眼、条纹的不同组合,不同品种外壁纹饰差异较大;根据极轴/赤道轴值（P/E值）,微型月季花粉可分为长球形和超长球形。（2）聚类结果表明,在相似系数为0.37时,可分为3组：第1组包括‘白柯斯特’、‘粉柯斯特’、‘紫微星’和‘罗曼蒂克’,特点是花粉外壁纹饰的条纹、网眼均密集;第2组包括‘金太阳’、‘小女孩’、‘矮仙女’、‘草裙舞女’和‘冬梅’,特点是花粉外壁纹饰的条纹密集,具瘤状雕纹,无网眼或较少;第3组为 ‘红云拉’,特点是花粉外壁纹饰的条纹和网眼较少。（3）结合不同微型月季品种外部形态指标的比较分析表明,孢粉学分类结果与形态学分类结果相似,但并不完全一致。【结论】不同微型月季品种花粉形状、萌发沟等特征近似,外壁纹饰差异较大,孢粉学分析结果可作为其品种分类依据,且分类结果总体支持形态学分类结果。     

版纳微型猪近交系KITLG基因克隆、组织表达及功能特性分析

【目的】研究KITLG基因在猪生殖细胞发育过程中的作用。【方法】从Gen Bank下载猪KITLG序列作为参考序列,设计特异引物从版纳微型猪近交系(BMI)附睾组织中扩增KITLG基因完全编码序列及部分侧翼序列;应用半定量PCR技术检测BMI 10个重要组织的KITLG m RNA转录表达水平,并对KITLG翻译的蛋白质序列进行多种功能生物信息学分析,预测KITLG蛋白质的功能,最后构建KITLG的多物种氨基酸系统进化树。【结果】扩增得到BMI KITLG编码区序列长825 bp,编码274个氨基酸,序列已提交Gen Bank,基因登录号KU705624,对应的氨基酸登录号AOC89042。多组织相对半定量表达分析表明:KITLG基因在附睾、心、脾、肺、肾、胃中高表达,在大脑、肝、小肠和睾丸中低表达。功能生物信息学分析表明:KITLG存在1个保守结构域SCF,有1个跨膜螺旋结构,存在N端信号肽序列,N末端和C末端均亲水,二级结构以α螺旋为主,有5类功能活性位点。系统进化分析表明:KITLG在进化中高度保守,且与牛、羊的亲缘关系最近。【结论】研究结果为探索BMI KITLG基因在生殖细胞发育过程中的作用及功能奠定基础。     

河西绒山羊次级毛囊超微结构的周期性变化

【目的】研究成年绒山羊次级毛囊组织超微结构的周期性变化过程,为研究绒山羊绒毛生长的分子调控机理奠定形态学基础。【方法】活体采集的皮肤样品,经3%的戊二醛前固定和锇酸的后固定,通过上行酒精梯度脱水后进行包埋。制作河西绒山羊一年周期内每个月的皮肤超薄切片,经铀和铅双染色后在透射电镜下进行超微结构的观察、拍照和分析。【结果】河西绒山羊次级毛囊组织的超微结构随着毛生长周期呈周期性变化,可分为5个不同的时期,即1-2月为休止期、3-4月为生长前期、5-8月为生长期、9-10月为退行前期、11-12月为退行期。【结论】阐述了河西绒山羊次级毛囊在一个完整的生长循环过程中所处的5个不同的时期,为绒山羊绒毛相关领域的研究奠定超微结构方面的基础。     

油棕花粉形态的观测及花粉萌发相关基因的表达研究

【目的】本文研究了花粉萌发过程中相关基因的表达。【方法】采用扫描电子显微镜观测厚壳种、薄壳种和无壳种3种不同果壳类型油棕花粉的形态,采用实时荧光定量PCR技术测定其花粉萌发前后的3个相关基因的相对表达量变化。【结果】3种类型油棕花粉粒形态相似,均以单粒形式存在,形状为边缘光滑的近正三角形,外壁均具网脊,网眼成浅穴状或兼具不规则小穿孔,其中厚壳种和无壳种中纹饰凸起,薄壳种中则较扁平,均具3条萌发孔沟。厚壳种、薄壳种和无壳种的花粉粒边长分别为32.86、32.51和33.87μm。GPI-anchored、MYB(x3)基因在3种类型的油棕花粉萌发前后均有表达,其中GPI-anchored萌发后较萌发前为下调表达;MYB(x3)在厚壳种中萌发前后相对表达量相同,无壳种中萌发后于萌发前为上调表达,薄壳种中萌发后于萌发前为下调表达;MYB在萌发前均有表达,萌发后仅在厚壳种中有表达,且为下调表达。【结论】可知GPI-anchored等3个基因参与油棕花粉萌发。