禽网状内皮组织增生症病毒p30蛋白的表达及检测

根据禽网状内皮组织增生症病毒SNV株的前病毒基因组cDNA序列设计并合成1对引物,以pPB101质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒p30基因片段。将PCR产物克隆入表达载体pCold-HF中,构建的原核表达质粒pCold-p30转化BL21（DE3）菌,经IPTG诱导,p30蛋白呈现可溶性表达。用表达产物免疫6周龄BALB/c小鼠,制备p30抗体,经Westernblot和间接免疫荧光法检测,结果发现,原核表达的SNV株p30蛋白具有良好的免疫原性。     

禽网状内皮增生症病毒gp90基因真核表达及ELISA检测方法的建立

为建立禽网状内皮增生症病毒(REV)的ELISA检测方法,本研究通过RT-PCR方法扩增gp90基因,构建杆状病毒重组质粒,转化DH10Bac后,通过转座获得重组杆粒,并将其转染Sf9昆虫细胞,SDS-PAGE及western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约为45 ku,具有良好的反应原性。将表达的重组蛋白纯化后包被ELISA反应板,建立检测REV抗体的rgp90-ELISA方法。特异性试验结果表明该方法具有良好的特异性;将该方法与IDEXX公司生产的试剂盒共同检测包括63份已知背景的血清在内的黑龙江省和广东省的临床血清样品共477份,符合率分别为90.5%和86.4%。该方法的建立为禽群REV抗体的监测提供了方便、快捷、准确的技术手段。     

ELISA法检测种蛋卵黄中禽网状内皮组织增生症病毒抗体的研究

为研究种蛋卵黄中禽网状内皮组织增生症病毒(REV)抗体的检测方法,运用IDEXX公司的REV抗体ELISA检测试剂盒,比较了不同提取方法、不同稀释倍数、不同洗液对卵黄中REV抗体检测结果的影响。结果显示:当用直接提取的卵黄液做300倍稀释检测,用含0.05%吐温-20的蒸馏水洗涤时,卵黄抗体的S/P比值与相应鸡群的血清抗体的S/P比值吻合度最高。应用本方法分别对50枚SPF种蛋和50枚普通鸡蛋进行检测,SPF种蛋均为REV抗体阴性;普通鸡蛋有4枚为REV抗体阳性,阳性率为8%。实验表明,种蛋卵黄ELISA抗体检测法可以代替传统血清抗体检测,为SPF鸡群的REV感染监测奠定了基础。     

禽网状内皮组织增生症病毒env蛋白的表达及其在ELISA方法中的应用

以pb101质粒为模板,PCR扩增禽网状内皮组织增生症病毒(REV)囊膜糖蛋白env基因片段.构建原核表达质粒pGEX-4T-3-env后,转化入宿主菌BL21,IPTG诱导表达env蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析.结果表明,表达的重组蛋白具有良好的反应原性,相对分子质量约66.4 ku.将表达产物纯化后作为包被抗原,建立了检测REV抗体的间接ELISA方法(Ienv-ELISA).经应用表明该方法具有良好的特异性、可重复性和敏感性,与IFA及iREV-ELISA结果相比其准确率均超过90%.该方法为检测REV抗体提供了一种快速、准确、简便的技术手段.     

基于非洲猪瘟病毒p30蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

p30是非洲猪瘟病毒(Africa swine fever virus, ASFV)感染早期表达的结构蛋白,为非洲猪瘟(ASF)早期诊断和抗体监测的重要靶标。为了建立ASFV ELISA抗体检测方法,本试验以重组p30作为检测抗原,通过方阵滴定法优化抗原包被质量浓度、封闭液以及待检血清和酶标抗体的稀释倍数;确立阴、阳性临界值,检测方法的特异性、敏感性和重复性;比较ELISA方法与商品试剂盒检测结果的符合率,并用Western blot对ELISA结果进行了验证。结果显示,ELISA方法的最佳抗原包被质量浓度为1 mg/L,封闭液为5%的脱脂奶粉,待检血清与酶标抗体的稀释倍数分别为1∶100和1∶5 000倍,阴、阳性临界值为0.294。该方法与伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒等抗血清无交叉反应,敏感性高于商品试剂盒,批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.723%和4.923%。初步应用显示,建立的ELISA方法的血清抗体阳性检出率高于商品试剂盒,两者的总符合率为62.1%。进一步验证表明,建立的ELISA方法与Western blot的结果一致。上述结果表明,建立的...     

禽网状内皮增生症病毒gp90蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为获得分泌抗禽网状内皮增生症病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,通过表达pET32a-gp90重组蛋白,以纯化的gp90蛋白为抗原,免疫BALB/c鼠,筛选分泌抗REV McAb的杂交瘤细胞株.经过细胞的融合及筛选,共获得能稳定分泌抗REV gp90的McAb细胞系2株,分别命名为A9E8和B3F8.2株细胞培养上清的效价均在1:4×102以上,腹水效价均在1∶8×103以上.亚型鉴定结果表明,2株皆为IgG型,轻链均为k链;Western blot及间接免疫荧光结果显示,这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能识别REV全病毒抗原,与其发生特异性反应,并且不与禽类其他病毒发生反应;病毒中和试验结果表明,获得的单克隆抗体均能REV临床分离株发生中和反应,具有较好的中和活性.利用制备的单克隆抗体建立了REV的间接免疫荧光检测方法,临床病料检测结果表明,该方法与病毒分离及PCR的检测结果基本一致,阴、阳性符合率分别为100％和90％.作者制备了针对REV gp90的McAb,为REV的快速诊断及抗原表位分析与鉴定等奠定了基础.     

禽网状内皮组织增生症病毒CA蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)DBYR1102株的前病毒基因组c DNA序列设计并合成1对引物,以p T-G质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒CA基因片段。将其克隆于pET-30a(+)中,构建原核表达质粒pET30a-CA。重组质粒经双酶切和测序鉴定,转化BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。利用Ni-NTA His Bind Resin纯化重组蛋白,并经蔗糖浓缩,Western blot法检测重组蛋白的反应原性。纯化后的目的蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗CA多克隆抗体并对其进行鉴定。结果表明构建的重组质粒pET-30a-CA在大肠杆菌BL21中呈可溶性高效表达。经Ni柱纯化和蔗糖浓缩后得到纯度较高的融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,抗体效价达1∶25 600。该研究为REV的检测及CA基因的深入研究奠定了基础。     

禽网状内皮组织增生症病毒囊膜糖蛋白gp90的原核表达

根据禽网状内皮组织增生症病毒（REV）SNV株的前病毒基因组cDNA序列，设计并合成1对引物，以SNV株前病毒CDNA全基因组克隆为模板，通过PCR技术，扩增出该病毒囊膜糖蛋白（env)gp90基因部分片段。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-5X-3载体中谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的下游，将重组质粒转化进宿主菌BL21中，在1.0mmol/L IPTG(37℃）诱导下，gp90基因部分片段以融合蛋白的形式获得了良好的表达。表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，确定其表达的融合蛋白相对分子质量为64000。将表达产物从凝胶中回收后免疫小鼠，所得的抗血清可与REV野毒株感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）在免疫荧光试验中起反应。由此表明，体外表达的SNV株gp90-GST融合蛋白保留了天然蛋白所具有的抗原性。     

禽网状内皮组织增生症病毒检测方法研究进展

禽网状内皮组织增生症(RE)是危害养禽业的一种重要病毒性肿瘤病。本文概述了禽网状内皮组织增生症病毒(REV)实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面,主要依靠病毒分离培养、病毒电镜形态检查、病毒特异性抗原及其抗体的检查等。在分子生物学方面,主要依靠国内外相继建立起的PCR、荧光定量PCR、LAMP技术及斑点分子杂交等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性,为临床兽医科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。     

禽网状内皮组织增生症病毒检测方法研究进展

禽网状内皮组织增生症（Reticuloendotheliosis,RE）是危害养禽业的一种重要病毒性肿瘤病。本文概述了禽网状内皮组织增生症病毒（REV）实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面,主要依靠病毒分离培养、病毒电镜形态检查、病毒特异性抗原及其抗体的检查等。在分子生物学方面,主要依靠国内外相继建立起的PCR、荧光定量PCR、LAMP技术及斑点分子杂交等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性,为临床兽医科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。     

间接ELISA检测抗禽白血病病毒抗体方法的建立

禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是禽白血病的病原,可引起鸡的免疫抑制和肿瘤。净化种鸡群是控制ALV的主要方法之一。本研究将ALV的p27基因克隆到表达载体pGEX-6P-1,在大肠杆菌中获得了高效表达,以纯化后的p27-GST融合蛋白为抗原包被,经过条件优化,建立了检测鸡血清中抗ALV抗体的间接ELISA方法。与IFA检测结果比较,该方法比IDEXX ELISA试剂盒有更高的符合率。可用于禽白血病病毒感染根除的大规模检测,并具有低成本、易操作的特点,能同时检测到针对ALV所有亚群的抗体。     

检测鸡传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA方法的研究

分别用绿猴肾细胞和鸡胚成纤维细胞殖鸡传染性鼻气管炎病毒NL7784株，提纯抗原建立了检测鸡传染性鼻气管炎病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA），试验的最佳反应条件为：抗原最佳稀释度为1：160，酶标抗体为1：1000稀释，待检血清为1：160稀释，包被液为pH9．0的碳酸盐缓冲兴，6％犊牛血清（CS）作封闭液，稀释液用含10％CS的Tween－20磷酸盐缓冲液，洗涤液用含0．5％Tween－20的磷酸盐缓冲液，抗原与抗体的最佳反应时间为30分钟，底物的反应时间为15分钟。与中和试验进行了比较，证明所产方法具有很好的特异性、稳定性、可重复性和较高的敏感性。     

Establishment and Preliminary Application of Indirect ELISA Based on Recombinant NS4 Protein for Detection of Bluetongue Virus Antibodies

This study was conducted to establish an indirect ELISA method for the detection serological antibody of bluetongue virus (BTV). The purified BTV recombinant NS4 protein obtained from the prokaryotic express system was used as the coated antigen, and then an indirect ELISA antibody detection method of BTV was developed by optimizing the reaction conditions. SDS-PAGE results showed that the recombinant NS4 protein with a size of about 52 kDa was obtained, which mainly existed in the supernatant. Western blot results showed that the purified recombinant NS4 protein had good antigenicity. The ELISA reaction conditions were optimized by the square matrix test. The optimal coating amount of recombinant NS4 protein antigen was determined to be 3.0 μg per well, and the optimal dilution ratio of serum to be tested was 1:200, and the optimal dilution concentration of HRP-labeled rabbit anti-cow IgG secondary antibody was 1:4 000, and the critical values were 0.29 and 0.35, respectively. The detection sensitivity of the BTV antibody was up to 1:1 600. The intra-assay repeatability and the inter-assay repeatability coefficient of variation were less than 10%. The positive coincidence ratio and negative coincidence ratio were 98% and 100% respectively. The indirect ELISA method established in this study laid a foundation for clinical serum antibody detection and serum epidemiological investigation of BTV.     

基于NS4蛋白的蓝舌病病毒间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

旨在建立蓝舌病病毒（BTV）血清学ELISA抗体检测方法,本研究以原核表达并纯化的BTV NS4重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种BTV重组NS4蛋白的间接ELISA抗体检测方法。SDS-PAGE结果显示,获得大小约52 ku的NS4重组融合蛋白,主要在上清中存在,Western blot显示,纯化后的重组蛋白具有良好的抗原性。通过方阵试验进行了ELISA反应条件优化,确定了重组蛋白抗原最佳包被量为3.0 μg·孔^-1;血清最佳稀释倍数为1：200,酶标二抗最佳工作浓度为1：4 000,临界值分别为0.29和0.35。上述以NS4蛋白作为包被抗原建立的BTV抗体间接ELISA方法检测敏感性可达1：1 600;批内和批间重复性变异系数均小于10%;检测76份重庆地区牛群血清样品,阳性符合率为98%,阴性符合率为100%。本研究建立的间接ELISA方法为临床BTV血清抗体检测及BTV血清流行病学调查奠定了基础。     

基于PCV3-Cap蛋白间接ELISA检测方法的建立及临床应用

为了建立一种敏感和特异的猪圆环病毒3型(PCV3)抗体检测方法,对PCV3-Cap蛋白抗原表位预测发现其抗原表位多聚集在C端(羧基端),而N端前33氨基酸为核定位序列。以截断N端前120个氨基酸后的PCV3ORF2序列为靶基因,设计引物。以PCV3阳性病料为模板,PCR扩增截短的ORF2基因,并将其克隆至pET-30a载体构建重组质粒,并转染至大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,获得重组菌后选择最佳诱导表达条件,采用Ni-NTA亲和层析柱纯化表达产物。以纯化后的重组Cap蛋白作为包被抗原,建立PCV3间接ELISA (indirectELISA)诊断方法,并初步用于临床样品检测。结果:从阳性病料中扩增出大小为285bp的PCV3ORF2基因片段,重组质粒经双酶切和测序鉴定构建成功。采用1mmol·L-1 IPTG诱导,在37℃条件下培养6h重组菌,重组蛋白获最佳表达。Western blot结果表明,该重组蛋白与PCV3阳性血清具有较好的反应原性。ELISA的最佳包被抗原质量浓度为1μg·mL-1,待检血清最佳稀释度为1∶20,酶标抗体最佳工作浓度为1∶5 000。阳性判定值为S/P≥0.273。批内和批间系数均小于10%,表明该方法具有较好的重复性。PCV2阳性血清用本方法检测为阴性,表明该方法有较好的特异性。检测采集的439份临床猪血清,PCV3抗体阳性检出率为60.59%(266/439)。结果表明,本研究建立了一种快速、简便、敏感、特异的猪圆环病毒3型(PCV3)抗体检测方法。     

基于非洲猪瘟病毒p30与p54蛋白表位串联多肽的间接ELISA抗体检测方法的建立

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的间接ELISA方法。本研究以两株纯化的ASFV p30与p54蛋白单克隆抗体(mAbs)为靶分子,利用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物淘选,筛选多肽表位,以氨基酸GGG为接头设计合成表位串联多肽作为包被抗原,通过棋盘滴定法确定间接ELISA的最佳反应条件,利用不同类型血清样本对建立的方法进行特异性分析、敏感度分析、稳定性分析及符合性评价。噬菌体淘选试验结果表明¹⁴⁶PAEPYTT¹⁵²为本实验室保存的mAb所识别的p54蛋白抗原表位核心序列。ELISA条件优化试验结果显示,以鸡卵白蛋白(OVA)作为N端偶联物的表位串联多肽抗原具有较低的非特异性血清反应背景,当多肽以碳酸盐缓冲液包被(2 μg·mL^-1),血清以封闭液(1%明胶溶液)稀释100倍,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体以0.05% PBST溶液稀释5 000倍时,反应效果最佳;以上述优化后的条件确定了血清抗体阳性临界值为0.339。方法评价试验结果显示,该方法与经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)的抗体阳性血清均无交叉反应,能检测低至1 600倍稀释的ASFV阳性血清,具有较好的重复性。用该方法与商品化的ASFV抗体检测试剂盒同时检测320份猪血清样本,两种方法的相对特异性和相对敏感性分别为97.6%与97.3%,总体符合率达97.5%(312/320)。综上表明,本研究建立的多肽间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,具有发展为临床诊断试剂盒的潜在应用价值。     

Development of an Indirect ELISA for the Detection of Antibodies against Peste-des-petits-ruminants Virus in Small Ruminants

Peste des petits ruminants (PPR) is an acute, febrile, highly contagious and economically important viral disease of small ruminants. A polyclonal antibody based indirect ELISA was developed for detection of antibodies to PPR virus in the serum samples of goats and sheep using purified PPR viral antigen propogated in Vero cell culture. A threshold (cut-off) value was set as twice the mean of the negative population based on the distribution of known negative serum samples in respect of PPR virus antibodies in the test. A total of 1544 serum samples from goats and sheep were screened by indirect ELISA and competitive ELISA. The indirect ELISA compared very well with competitive ELISA, with a high degree of specificity (95.09%) and sensitivity (90.81%). When compared with virus neutralization test, the present assay had 100% specificity and 80% sensitivity. With serum samples, the assay could clearly differentiate animals from the infected population from uninfected ones. These results suggest that the indirect ELISA may be a good alternative tool to competitive ELISA for seroepidemiological surveys.     

基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72（p72s）蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性;最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过Western blotting验证ELISA的检测结果。【结果】ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5 μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5 000;反应条件为：抗原于37 ℃孵育1 h后经4 ℃包被酶标板过夜、于37 ℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37 ℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为：当待检血清的D_{450 nm}值≥0.365时,判定为阳性;当D_{450 nm}值＜0.365时,判定为阴性。该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量（0.110~0.554 mg/mL）;批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%。对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%（94/124）和32.26%（40/124）。进一步验证表明,Western blotting与ELISA的检测结果完全一致。【结论】建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法,该方法特异、敏感和重复性稳定,能够用于ASF临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。     

鸡传染性法氏囊病血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立可检测鸡传染性法氏囊病血清抗体的间接ELISA检测方法,本研究经RT-PCR扩增IBDV VP2（1nt-708nt）基因片段,并应用pET28a载体进行原核表达,亲和层析纯化重组蛋白作为包被抗原,建立检测IBDV血清抗体的间接ELISA方法。应用所建方法和IDEXX试剂盒,对采自不同地区的156份鸡血清样品进行平行检测和比较。结果表明,RT-PCR扩增获得708bp的VP2基因片段;含重组表达质粒pET28a-VP2的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后,表达了约27kDa的VP2重组蛋白,表达量约占菌体蛋白的30.1%;建立的间接ELISA检测方法与IDEXX试剂盒比较,其特异性、敏感性和符合率分别达到90.24%、95.65%和94.23%。由此可见,本研究所建立的间接ELISA方法敏感、特异,适用于IBDV血清抗体的检测。