鹅细小病毒NS1基因的克隆及原核表达

本研究根据GenBank发表的GPVB株全基因核苷酸序列，设计了1对用以扩增GPV主要非结构蛋白NS1基因的引物。通过PCR技术，扩增出NS1完整基因片段1．9kb。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：GPV H1株NS1基因全长1884bp，编码627个氨基酸，与国外已发表的B株核苷酸序列同源性为98．15％。同时将该目的基因正向插入到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6P-1的BamH1多克隆位点，构建了GPV NS1的原核表达载体，成功的表达了约97KD的NS1融合蛋白。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆与表达

根据GenBank中收录的H5N1亚型禽流感病毒NS1基因序列设计合成了一对引物AI-N1/AI-N2,利用RT-PCR方法扩增AIVNS1基因并克隆到pMD18-T载体上,对所得到的重组质粒进行酶切分析及序列测定,与GenBank中收录的其他分离株NS1基因进行序列比较分析,同源性达96%~99%,含有NS1基因的1个开放性阅读框(ORF)。将该基因克隆到pET-28a中构建NS1基因原核表达质粒pET/NS1,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下获得了预期的蛋白表达,所表达的蛋白质分子质量约为30kD。Western-blotting结果表明表达的NS1蛋白有良好的生物学活性,与H5N1 AIV感染鸡血清发生特异性反应,而与H5N1 AIV灭活疫苗免疫鸡血清无反应,为建立区分野毒AIV感染家禽与AIV灭活疫苗免疫家禽ELISA方法的建立提供了生物学材料。     

H9N2禽流感病毒分离株NS基因同源性分析

经RT-PCR扩增了三株国内H9N2亚型禽流感病毒(ATV)分离株的非结构(NS)蛋白基因,并把扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体中测序,获得了NS1和NS2蛋白的完整编码序列.经与GenBank中发表的核苷酸序列比较表明,这三株病毒的NS基因之间的同源性为96%～98%;与1994年以来香港、韩国H9N2亚型分离株NS基因的同源性均在90%以上;其NSI蛋白的C-末端都缺失13个氨基酸,不同于香港分离株;在AIV NS基因系统发育进化树中,三者都处于等位基因A类的亚洲禽-猪群分枝.     

两株不同亚型禽流感病毒NS1基区的表达及抗原性检测

为进一步研究禽流感病毒非结构蛋白NS1的功能及其在临床中的应用，本试验分别对H5N1、H9N2两株不同亚型禽流感病毒的NS1基因进行了原核表达及抗原性检测。实验分别用限制性内切酶EcoRI和XhoI消化不同亚型NS1基因的重组质粒pMD-18T-NS1（H9N2）和pMD-18T-NS1（H5N1），获得目的片段NS1．然后将NS1基因克隆到原核表达载体pProEXHTc中。将重组质粒pProc-NS1（H9N2、H5N1）转化DH5α感受态细胞，用1mmol／L IPTG诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE检测，目的蛋白分子量大小为30ku．与预期结果相符。Westera-blot检测表明所表达的蛋白能与NS1的多克隆抗血清反应．并且存在交叉反应。     

禽流感病毒A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因的克隆及序列分析

根据GenBank公开发表的H9N2型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计1对引物,用RT-PCR方法成功扩增出H9N2型禽流感病毒分离株A/Chicken/Yangzhou/N/2005(H9N2)HA基因,凝胶电泳结果显示,扩增产物为1.7 kb的单一条带,与预期结果相符.将PCR扩增片段连接到pCR2.1-T载体上,重组质粒酶切鉴定正确.序列测定分析结果显示,所获序列与GenBank中收录的H9N2亚型分离株核苷酸同源性最高达99%,与原型毒株A/Furkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)氨基酸同源性为89%.对HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明,此毒株为低致病力毒株.     

两株不同亚型禽流感病毒NS1基因的表达及抗原性检测

为进一步研究禽流感病毒非结构蛋白NS1的功能及其在临床中的应用,本试验分别对H5N1、H9N2两株不同亚型禽流感病毒的NS1基因进行了原核表达及抗原性检测。实验分别用限制性内切酶EcoRI和XhoI消化不同亚型NS1基因的重组质粒pMD-18T-NS1(H9N2)和pMD-18T-NS1(H5N1),获得目的片段NS1,然后将NS1基因克隆到原核表达载体pProEXHTc中。将重组质粒pProc-NS1(H9N2、H5N1)转化DH5α感受态细胞,用1mmol/LIPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测,目的蛋白分子量大小为30ku,与预期结果相符。West-ern-blot检测表明所表达的蛋白能与NS1的多克隆抗血清反应,并且存在交叉反应。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及表达

利用RT-PCR扩增了2株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并将其克隆到pMD 18-T载体上,进行序列分析.结果显示,这2株禽流感病毒NS1基因核苷酸序列的同源性为70.2%,分别属于NS等位基因群A和等位基因群B.再将克隆的NS1基因插入到pET-28a质粒中构建原核表达载体,将其转化到DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞中,经双酶切鉴定及序列分析,表明获得了重组质粒pET-52NS1和pET-174NS1.经SDS-PAGE分析,重组质粒转化BL21（DE3）（pLysS）感受态细胞后,经IPTG诱导,获得了分子质量约为30 ku的NS1融合蛋白.用AIV多克隆血清做Western-blotting分析,发现来自2个等位基因群的NS1蛋白都具有较好的抗原活性.     

鹅细小病毒NS2基因的克隆和序列分析

本研究参考CerBank发表的GPV B株全基因序列，设计并合成一对引物，通过PCR技术扩增出GPV H1株NS2基因，目的片段长约1．4kb，将目的片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析，结果表明：GPV H1株NS2基因全长1356bP，编码451个氨基酸，与国外已发表的GPV B株相比核苷酸序列同源性为98．75％，推导氨基酸序列同源性为98．67％。     

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）0RF2基因序列，设计一对引物，应用PCR从本室鉴定分离的PCV2 GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得重组质粒pMD—ORF2并对其测序，结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的0RF2基因核苷酸序列同源性在92．1％～99．9％之间，推导的氨基酸序列同源性在90．2％～99．5％之间。     

H5N1 亚型禽流感病毒NS1的克隆和原核表达

利用RT-PCR技术扩增了一株H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的NS1基因,克隆到pGEM T-easy载体上,经序列测定和分析正确后,将该基因插入到pET-32a载体中构建原核表达载体pET-NS1,阳性重组质粒转化BL21感受态细胞,用1mmol/L的IPTG诱导和SDS-PAGE电泳后获得了分子质量约为51ku的NS1融合蛋白。通过Western-blotting发现NS1蛋白可与H5N1亚型AIV单因子血清反应。为建立H5N1亚型AIV野毒株和疫苗株的特异性鉴别方法奠定了基础。     

禽流感病毒A/Chicken/Mudanjiang/0823/00(H9N2) 株NS1基因的克隆及序列分析

用PCR方法,成功扩增出国内分离株禽流感病毒H9N2型非结构蛋白(NS1)基因cDNA,并将该片段连接到pMD 18-T载体上,转化TGI感受态细胞,在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆,提取质粒,经限制性内切酶鉴定,对目的片段进行测序,结果获得了NS1基因全长,约700bp.该片段的核酸序列与已知A/Chick/HongKong/1074/99(H9N2)、A/Chick/HongKong/1073/99(H9N2)毒株序列进行同源性比较,同源性皆为94.37%,氨基酸序列同源性分别为93.91%和93.48%.     

山羊关节炎-脑炎病毒甘肃株env基因的克隆和序列分析

本试验参考GenBank上发表的CAEV-63株的env基因核苷酸序列设计一对引物，以CAEV甘肃株前病毒DNA为模板，PCR扩增产物约2．9kb，与预期的目的片段大小一致。回收目的基因片段并将其克隆到pMD18-T载体上，经PCR及酶切鉴定阳性的重组质粒测序，结果表明所扩增2893个核苷酸片段含有CAEV囊膜基因的全序列，编码964个氨基酸。核苷酸和氨基酸序列分析显示，CAEV甘肃株env基因与CAEV-63美国株的env基固核苷酸和氨基酸的同源性分别为99．0％和98．1％。     

鹅细小病毒NS2基因的原核表达及抗原性检测

为原核表达鹅细小病毒(GPV)NS2蛋白,本研究利用特异性引物扩增获得GPV的H1分离株NS2基因,将其克隆于pMD18-T载体后进行序列测定。并将NS2基因亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-NS2。该质粒转化于感受态菌BL21(DE3)plysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为75ku左右。经过亲和层析方法获得了纯化的重组NS2蛋白。Westernblot和Dot-ELISA鉴定结果表明,表达的重组NS2蛋白可以与GPV阳性血清发生特异性反应。     

狂犬病病毒核蛋白基因的克隆序列分析及其在E.coli中的高效表达

对狂犬病病毒（RV）ERA株核蛋白（N）基因进行了克隆和序列分析。根据GenBank中已发表的RVN基因序列，设计合成了1对特异性引物，对RV ERA株N基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pMD18T连接得到重组质粒pMD-N，并进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1353bp，编码450个氨基酸。RV ERA株与CVS-11、PV-11、SRV9和SAD—B19株相比，核苷酸的同源性分别为98％、98．3％、99％、99.6％，推导的氨基酸的同源性分别为98％、99％、99％、99.6％。将pMD-N双酶切，回收目的基因片段并克隆到原核表达载体pET28a（＋）中，构建了重组质粒pETN；将其转化表达菌BL21（DE3）并用IPTG进行诱导表达。结果重组菌裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为53kDa的重组蛋白。经凝胶薄层扫描分析，重组蛋白表达量占菌体蛋白的56．8％，Western-blot结果显示该重组蛋白能与RV多克隆抗体发生特异性反应。     

A型禽流感病毒H7N9株NS1基因的克隆和真核表达

目的:构建H7N9亚型禽流感病毒NS1基因真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的蛋白。方法:提取H7N9亚型禽流感病毒分离株总RNA,RT-PCR扩增获得NS1的全长基因,克隆至真核表达载体pRK中构建pRK-FLAG-NS1,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到293T细胞中,Western blot技术鉴定NS1蛋白的表达。结果:成功克隆了NS1全长基因,构建了H7N9毒株的NS1蛋白真核表达载体pRK-FLAG-NS1并转染于293T细胞中。结论:Western blot分析表明,NS1蛋白得到成功表达,为开展流感病毒蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。     

河北省猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因的核苷酸序列，设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了0RF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中，筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB—ORF2。对质粒中的插入片段测序后，应用DNAStar序列分析软件，对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果，3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100％；它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高，达99．5％。     

鹅细小病毒VP1基因的克隆及序列分析

参照GenBank中收录的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列设计并合成了扩增GPV H1株VP1的1对引物，利用PCR技术扩增出长约2．2kb的目的片段，将其克隆到pMD 18-T载体上，进行了序列测定及分析。测序结果表明，GPV H1株VP1基因由2199个核苷酸组成，编码732个氨基酸。经与B株、YG株进行同源性比较，核苷酸的同源性分别为98．50％和93．18％；推导的氨基酸同源性分别为98．09%和95．77％。     

番鸭细小病毒NS2基因的克隆和序列分析

本研究参考GenBank发表的MDPVFM株全基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR技术扩增出MDPVS1株NS2基因,目的片段长约1.3 kb,将目的片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果表明,MDPVS1株NS2基因全长1357 bp,编码451个氨基酸,与国外已发表的MDPVFM株相比核苷酸序列同源性为99.26%,推导氨基酸序列同源性为98.23%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株GF1107株ORF7基因的克隆与表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCC VR2332株的核衣壳蛋白基因的核苷酸序列，设计并合成1对特异性引物。应用RT-PCR方法扩增PRRSV GF 1107株（GenBank登陆号：AY684124）的ORF7片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中获得含有相应片段的重组质粒pMDHB-ORF7。对质粒中的插入片段进行测序，应用DNAstar序列分析软件对所测序列与GenBank中PRRSV毒株进行同源性比较。将0RF7基因克隆入原核表达载体pET-32a（＋）中，在IPTG的诱导下成功获得表达，经Western blotting分析表明。表达蛋白能够与PRRSV的阳性血清发生特异性反应，为PRRSV新型诊断试剂的研究奠定了基础。     

鹅细小病毒NS2基因的克隆和序列分析

参照GenBank发表的GPVB株全基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR技术扩增出GPVS1株NS2基因,目的片段长约1.4kb,将目的片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果表明:GPVS1株NS2基因全长1356bp,编码451个氨基酸,与国外已发表的GPVB株相比核苷酸序列同源性为98.89%,推导氨基酸序列同源性为98.89%。