食品中单增李斯特菌荧光PCR检测方法的建立

以单增李斯特菌的hly A基因为靶序列,针对该序列保守区,设计一对特异性引物和探针。通过反应体系和反应程序的优化,建立起单增李斯特菌荧光PCR检测方法,并以单增李斯特菌和9种相关细菌考核该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果表明该方法特异性和重复性好,具有较低的灵敏度,最低可检测到5 cfu/m L。临床样品检测中,该方法与国标法结果一致,说明研究建立的单增李斯特菌荧光PCR方法是快速鉴定单增李斯特菌的有效方法,具有较大的应用和推广价值。     

肉中两种致病菌的双重PCR检测方法的建立

为了建立肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重PCR检测方法,以金黄色葡萄球菌nuc基因和单增李斯特菌hly基因为靶基因设计引物,通过优化退火温度和PCR反应体系,建立这两种菌的双重PCR检测方法,并分析其反应特异性和敏感性。进一步将该方法应用到人工模拟肉样中,并分析其敏感性。结果表明,建立的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重PCR检测方法应用于人工模拟肉样中具有较高敏感性,其中金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌最低检测限分别为102和103 cfu.mL-1。该方法的建立为食品中多种致病菌的同时检测奠定了基础。     

单增李斯特菌基因组DNA提取方法比较

为了选择一种简单、快速、有效的单增李斯特菌基因组DNA的提取方法,采用溶菌酶-蛋白酶K法、氯仿/异戊醇法、液氮冻融法提取单增李斯特菌基因组DNA,利用PCR扩增结果判断所得DNA样品的质量.结果为,3种不同方法均能扩增出234 bp条带,溶菌酶一蛋白酶K法提取的DNA模板检出限最低,为1.25 x 10,CFU/mL.结论为,溶菌酶-蛋白酶K法提取的DNA模板进行PCR扩增检出限最低,该方法提取的基因组DNA适用于PCR扩增和其他分子生物学研究.     

鸡单增李斯特菌全菌灭活苗的制备与效果检测

采用甲醛将分离自鸡的单增李斯特菌灭活后再与弗氏完全佐剂按体积比1:1混合制备成全菌灭活疫苗,通过平板划线和动物接种试验对制备的疫苗进行安全性与免疫效力检验.结果表明,15日龄京粉雏鸡接种1×1010 CFU/mL抗原含量的全菌灭活苗后无异常反应,注射部位及内脏器官无病变损伤,对致死量的本菌攻毒具有100％的保护率;1×109 CFU/mL抗原保护率达85％以上,表明所制备的全菌灭活苗具有对雏鸡具有较好的免疫效力.     

实时荧光PCR法与国标法检测单增李斯特菌比较

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是食源性致病菌之一,可引起人和动物患病。对食品中单增李斯特菌进行检验,对保障食品安全至关重要。为明确实时荧光PCR法在食源性单增李斯特菌检测中的最低检出限以及在不同食品类型中的检出效率,对实时荧光PCR法检测单增李斯特菌的最低检出浓度进行了摸索与验证,对人工污染单增李斯特菌的豆粉、饼干、生菜、猪肉4种食品,在不同培养时间点取样采用实时荧光PCR法检测,同时与国标法GB 4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》检测进行了比较。结果表明,实时荧光PCR法具有检测速度快、灵敏度高的优点,可在快速检测中应用,但因其死菌可以产生假阳性问题,而国标法检测可以分离得到污染菌株用于后续研究,因此,建议对于实时荧光PCR法检测阳性的样品用国标方法复检确认。     

检测牛奶中布鲁氏菌套式PCR方法的建立

为检测牛奶中的布鲁氏菌,通过对布鲁氏菌外膜蛋白31 k Da的一段基因进行套式PCR扩增,建立从临床奶样中检测布鲁氏菌的方法。改进了奶样中布鲁氏菌基因组DNA的提取方法,通过正交试验的方法优化了套式PCR试验的反应条件,优化后的一扩PCR反应条件为:退火温度56.4℃,Mg~(2+)浓度1.5 m M,rTaq酶0.2μL,引物0.3μM,d NTP浓度0.2 m M;二扩PCR反应条件为:退火温度53.3℃,Mg~(2+)浓度1.5 m M,rTaq酶0.25μL,引物0.4μM,d NTP浓度0.1 m M。其敏感性为8 CFU·m L~(-1),比细菌分离试验敏感1 000倍;与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、隐秘杆菌和克雷伯氏菌均无交叉反应;与试管凝集试验检测布鲁氏菌病的阳性符合率是100%,阴性符合率是86.36%。试验建立的套式PCR方法可用于检测奶样中布鲁氏菌。     

3种单增李斯特氏菌快速检测方法的比较

【目的】确定适用于不同条件下快速检测单增李斯特氏菌的方法。【方法】以单增李斯特氏菌标准菌株CMCC54004和市售盐水鸭、凉拌菜为研究对象,按照国家食品安全标准(GB 4789.30-2010)对检测样品进行选择性增菌培养,选择阴性样品进行人工布菌,比较单增李斯特氏菌蛋白条检测法、CPA恒温扩增法以及实时荧光PCR方法的检测效果,并以传统平板分离法进行验证。【结果】蛋白条检测法操作简单但灵敏度低,最低检测限为106cfu/mL;实时荧光PCR方法灵敏度高,最低检测限为101 cfu/mL,但操作繁琐,对操作技术及实验室条件要求较高;CPA恒温扩增方法灵敏度相对较高,最低检测限为105 cfu/mL,操作相对简单。【结论】实时荧光PCR方法适合灵敏度要求高、且具备良好实验条件时使用;CPA恒温扩增法适于对灵敏度要求不高、实验室条件简单的基层实验室使用。     

TaqMan探针实时定量PCR检测肉中单增李斯特菌的研究

根据GenBank公布的单增李斯特菌的hlyA基因序列设计一对引物和一条TaqMan探针,在分析特异性基础上,构建阳性重组质粒进行荧光定量PCR扩增,制备标准曲线,分析敏感度。进一步将该方法应用到人工染菌肉样中,分析其最低检出限。结果表明,该方法对10株单增李斯特菌均可产生特异性扩增曲线,其他6株非单增李斯特菌不产生扩增曲线,表明该方法具有较强的特异性。对阳性重组质粒定量扩增所建立标准曲线的相关系数为0.998,敏感度为19.5 copies.μL-1。该法对人工染菌肉样中单增李斯特菌的最低检出限为2.8×102cfu.g-1。该方法特异性强、敏感性高,可为肉中单增李斯特菌的快速、准确的定量检测奠定基础。     

散装盐水鸭中单增李斯特菌的风险等级评估

将市场调查数据与国内文献报道的统计分析结果相结合,运用半定量风险评估软件Risk Ranger,对南京市散装盐水鸭中单增李斯特菌的风险程度进行分级。结果表明,南京市散装盐水鸭中单增李斯特菌的风险评分为61分,属于高风险,每人每天因食用污染该菌的产品造成食物中毒的概率为2.90×10-4。通过进一步研究发现,加工后采取有效的控制体系,可使风险降低10倍。南京市散装盐水鸭是引发单增李斯特菌病的高危食品,需做好预防措施,加强监管。     

单增李斯特菌溶源性噬菌体的诱导及鉴定

利用丝裂霉素C诱导获得单增李斯特菌溶源性噬菌体,并确定其核酸类型。PCR及其扩增产物的序列测定检测原噬菌体,透射电子显微镜观察丝裂霉素C诱导获得的溶源性噬菌体颗粒,DNase I、RNase A和绿豆核酸酶分别消化噬菌体基因组,确定噬菌体的核酸类型。结果显示,38株单增李斯特菌分离株中的16株在tRNAArg位点携有原噬菌体,其中1株可诱导出噬菌体颗粒,该噬菌体为长尾噬菌体,核酸为dsDNA。噬菌体的成功诱导为噬菌体及其功能基因的开发利用奠定了基础。     

3种检测布鲁氏菌荧光定量PCR方法的比较

为了筛选适用于家畜布鲁氏菌病检测的荧光定量PCR方法,合成目前报道最多的布鲁氏菌IS711插入序列、per基因和bcsp31基因的引物和探针,并分别对这3种荧光定量PCR方法的敏感性、特异性、重复性以及63份临床样品检测效果进行比较。结果显示：3种荧光定量PCR方法均具有较好的敏感性且均不与其他常见细菌发生交叉反应;3种方法的批内变异系数和批间变异系数均小于5%。在检测临床样品时,3种方法的敏感性均高于套式PCR方法,其中IS711荧光定量PCR方法与套式PCR方法符合率为95.24%,其他2种方法与套式PCR方法的符合率为98.41%。比较而言,IS711荧光定量PCR敏感性最高,更适合于布鲁氏菌核酸含量低的样品的检测。     

单核细胞增生李斯特菌噬菌体裂解酶Lys039的活性分析及初步应用

为探究单核细胞增生李斯特菌噬菌体裂解酶的特性及在食品基质中的初步应用,从NCBI获取李斯特菌噬菌体裂解酶lys039基因序列,分析其生物信息学,并在大肠杆菌中表达纯化,研究其裂解活性、对生物被膜的影响以及在牛奶基质中的应用。结果表明：1）裂解酶Lys039由341个氨基酸组成,分子质量为36.4 ku,等电点为9.81,其结构具有酰胺酶活性,对本实验室22株单核细胞增生李斯特菌、2株无害李斯特菌、1株伊氏李斯特菌以及1株威氏李斯特菌具有裂解活性,但是对葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及沙门菌没有显示出裂解活性。2）随着Lys039浓度的升高,裂解活性逐渐增强,最适温度为30 ℃,最适pH值为6.0。3）Lys039能显著清除单核细胞增生李斯特菌形成的生物被膜,并且可以降低牛奶中单核细胞增生李斯特菌的细菌数量。综上,Lys039温度耐受范围广、耐酸耐碱且裂解谱较宽,可显著清除生物被膜以及初步应用效果良好。 本研究为进一步防治及快速检测单核细胞增生李斯特菌提供理论基础。     

产气荚膜梭菌毒素型菌落多重PCR方法的建立及应用

根据产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因cpa、cpb、etx、iA设计并合成4对特异性引物,建立快速鉴定产气荚膜梭菌毒素型的多重PCR方法。结果显示:产气荚膜梭菌A、B、C、D和E型参考菌株均扩增出相应的片段,而肉毒梭菌、气肿疽梭菌、腐败梭菌、诺维梭菌的扩增均为阴性;将产气荚膜菌株单个菌落稀释100倍,仍能扩增出相应的目的片段。利用此多重PCR方法对16株不同动物来源的产气荚膜梭菌进行分型鉴定,并与毒素中和试验鉴定结果进行比较,结果显示2种方法具有较高的符合率。该方法可有效进行产气荚膜梭菌的快速检测和分型,对产气荚膜梭菌感染与食品安全问题的研究具有参考价值。     

鉴定动物奶源的多重RCR方法建立及应用

为准确鉴别牛奶、山羊奶、绵羊奶、马奶以及骆驼奶,利用多重PCR方法建立奶制品DNA提取方法及奶制品质量检测体系。结果表明: 1)建立的奶制品DNA提取方法不受食品添加剂影响,提取过程简便快速高效,可于2 h之内全部完成,提取质量浓度不低于100 ng/μL,纯度介于1.70~2.10,适用于常见液态奶DNA提取;2)建立的多重PCR体系中各引物种属特异性强,无交叉干扰;3)检测灵敏度为1 ng/μL;4)对24 份人工模拟混合奶样进行检测,准确度达100%,随机抽样重复检测3 次,检测结果稳定;5)对本地区市场销售液态奶样品10份(牛奶5份,羊奶1份,山羊奶1份,马奶2份,骆驼奶1份)进行检测:牛奶、马奶及骆驼奶奶源检测结果与产品标识相符;2份羊奶样品分别标识鲜羊奶及鲜山羊奶,但检测结果显示存在牛源性强阳性信号,怀疑存在牛源性成分掺假。     

食品中单增李斯特菌检测技术研究进展

单增李斯特菌是一种重要的人畜共患食源性致病菌,如何有效控制食品(尤其是即食食品)中的单增李斯特菌,是食品安全的重要任务,其中快速、准确的检测技术是关键因素之一.作者对单增李斯特菌的传统检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法进行综述,并对目前国内单增李斯特菌检测过程中所存在的问题进行探讨,以期为今后的研究提供参考.     

SigmaB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌毒力的影响

为了解缺失SigmaB基因对单核细胞增生性李斯特菌（LM）的毒力影响。通过体外生长试验、巨噬细胞RAW264.7的粘附与侵袭试验、小鼠肝脾载菌量试验、毒力基因转录水平试验、小鼠LD₅₀试验来研究缺失株（LM XS5 △SigmaB）的毒力变化。结果显示,与野毒株相比,缺失株体外生长能力减弱、侵袭率和粘附率降低,小鼠肝脾载菌量显著减少,毒力基因（inlA、inlB、hly、prfA、actA）的转录水平降低,而小鼠LD₅₀升高。可见,SgmaB基因对LM的毒力具有重要的调控作用,为LM基因缺失疫苗和活疫苗载体的研发可资借鉴。     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。     

冷藏原料乳中荧光假单胞菌的分离鉴定及其产蛋白酶特性研究

【目的】对冷藏原料乳中易污染的嗜冷菌进行分离筛选,为提高乳品品质、控制乳品质量提供参考。【方法】从冷藏原料乳中筛选出1株嗜冷菌,通过形态学观察、生理生化试验、16SrDNA分子生物学分析,对该株嗜冷菌进行鉴定;并采用福林-酚试剂法、蛋白酶定性检测试验、耐热性试验以及牛奶酸度、黏度影响等试验,对其产酶特性进行研究。【结果】从冷藏原料乳中分离出的该株嗜冷菌为革兰氏阴性短杆菌,与GenBank中登录的荧光假单胞菌的生理生化特征相符,二者同源性为92.5%~97.6%。对该菌产胞外酶能力的研究发现,该菌所产胞外酶为一种耐热碱性蛋白酶,最适温度为30℃,最适pH为8.0,可引起牛乳黏度增大、凝集和乳清析出。【结论】从冷藏原料乳中分离出了嗜冷荧光假单胞菌,该菌所产胞外碱性蛋白酶会引起牛乳黏度增加、凝集和乳清析出,明显缩短乳品的保质期。     

禽多杀性巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

为了建立鉴别禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)和大肠杆菌(Escherichia coli)的多重PCR检测方法,参照GenBank中登录的3种细菌基因组序列,合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立快速检测3种细菌的多重PCR方法。特异性试验结果表明,可分别扩增出3种细菌对应的目的片段,对Ⅰ群禽腺病毒4型(FAV-4)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellaspp)、鸡胚成纤维细胞(DF-1)的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验结果表明,最低检测量分别为24.3pg/μL禽多杀性巴氏杆菌、21.4pg/μL副鸡嗜血杆菌和28.6pg/μL鸡大肠杆菌的基因组DNA;应用该方法对83份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单重PCR检测一致,说明所建立的方法可用于临床上3种细菌的鉴别诊断。