牛肌生成抑制素基因全序列的克隆及原核表达

根据GenBank上发表的牛肌生成抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,利用RT-PCR技术,以牛肌细胞总RNA为模板,对牛的肌生成抑制素(MSTN)基因编码序列进行扩增.经酶切鉴定、DNA测序和氨基酸序列分析证实MSTN基因克隆成功.从pMD18T-MSTN克隆中获得MSTN编码序列,将其与pET32a( )质粒连接,构建pET32a( )-MSTN重组质粒,重组菌经IPTG诱导在大肠杆菌中表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的,SDS-PAGE特异区带分子量为60 ku.     

猪肌生成抑制素下游编码基因的合成及其克隆

将猪肌生成抑制素编码序列下游883～1 126bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化，将优化后序列双链分成12个单链片段，F1、F2、F3、R6、R5、R4、F4、F5、F6、R3、R2和R1，采用化学合成方法合成，每对相邻互补片段之间有20bp序列交叉重叠。Fl长38bp，R1长36bp，其他片段均40bp长，Fl和R1片段两端分别加上限制性内切酶NCoⅠ和XhoⅠ的识别位点序列。经PCR扩增出254bp片段，该片段与pMDI8-T载体连接，转化JM109感受态细胞，所得阳性克隆进行测序分析，得到的克隆序列与设计的序列完全一致。表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体。     

猪肌生成抑制素功能区编码基因的原核表达与纯化

根据猪肌生成抑制素基因设计1对引物,PCR扩增出猪肌生成抑制素功能区编码基因片段,将该片段克隆至pGEM-T载体中。重组克隆质粒经序列分析,克隆序列与目的基因序列完全一致。重组克隆质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,目的基因片段克隆到表达质粒径pGEX-4T-1,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,融合蛋白占菌体可溶性总蛋白的18%以上。     

峨边花牛肌肉生长抑制素基因cDNA克隆及序列分析

[目的]为改良峨边花牛地方品种、提高产肉率及种质资源的保存奠定基础和提供技术依据。[方法]以从乐山峨边花牛骨骼肌中提取总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增获得肌肉生长抑制素基因(MSTN)cDNA片段,将其克隆到T载体上,通过PCR鉴定阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增,得到峨边花牛MSTN基因cDNA的全序列,全长1 135 bp,包含全部的MSTN编码序列,共有3个外显子。将峨边花牛MSTN基因在GenBank上与比利时双肌牛及皮埃蒙特双肌牛比较后发现,峨边花牛在上述2种品种双肌牛的突变位点碱基未发现异常。[结论]成功地克隆峨边花牛的MSTN基因并对其进行测序对于后期表达载体的构建奠定了基础。     

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列的表达与纯化

猪肌生成抑制素基因myostatin(MSTN)的cDNA在去除信号肽后,对成熟蛋白编码序列PCR扩增出1.2kb片段,将该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109受体菌细胞,筛选阳性克隆,并测序分析,结果表明其与设计序列完全一致。将该克隆载体的质粒DNA用带有BamH 和Sal 内切酶识别序列的另1对引物进行PCR扩增,将回收的1.2kbPCR目的片段定向克隆到pET28a(+)表达载体上,成功地构建了猪肌生成抑制素成熟蛋白编码的原核表达载体。对成功构建的表达载体阳性克隆在LB液体培养基中用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳显示,重组菌表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的;SDS-PAGE凝胶经薄层扫描仪扫描分析,表达的MSTN包涵体蛋白占菌体不溶性蛋白含量的27.9%,表达的MSTN分子质量为41.4513ku。因为所构建的表达载体中含六聚组氨酸标签,用His-trap亲和柱进行纯化后,纯度可达92.5%。     

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列的表达与纯化

 猪肌生成抑制素基因myostatin (MSTN)的cDNA去除信号肽后对成熟蛋白编码序列PCR扩增出1.2 kb片段,将该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109受体菌细胞,筛选阳性克隆测序分析,结果表明与设计序列完全一致。将该克隆载体的质粒DNA用带有BamH I和Sal I内切酶识别序列的另一对引物进行PCR扩增,将回收的1.2 kb PCR目的片段定向克隆到pET28a（+）表达载体上,成功地构建了猪肌生成抑制素成熟蛋白编码的原核表达载体。对成功构建表达载体阳性克隆在LB液体培养基中用IPTG诱导表达, SDS-PAGE凝胶电泳显示,重组菌表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的;SDS-PAGE凝胶经薄层扫描仪扫描分析,表达的MSTN包涵体蛋白占菌体不溶性蛋白含量的27.9%,表达的MSTN分子量为41 451.3D. 因为所构建的表达载体中含六聚组氨酸标签,则用His-trap亲和柱进行纯化后,纯度可达92.5%. 该试验为获得较好的猪肌生成抑制素基因抗原、制备抗体打下了良好的基础。     

陆川猪肌肉生长抑制素基因的克隆与序列分析

[目的]对陆川猪肌肉生长抑制素（MSTN）基因进行克隆及序列分析,为后期开展MSTN因表达与陆川猪肌肉生长发育及脂肪沉积的相关性研究奠定基础.[方法]根据GenBank中已发表的猪MSTN因序列（NM 214435）设计引物,以陆川猪背最长肌组织总RNA为模板,RT-PCR扩增MSTN因cDNA序列,扩增片段经纯化、克隆、鉴定和测序分析,并应用生物软件进行蛋白质二级结构预测.[结果]克隆得到陆川猪MSTN因编码区1128 bp,与GenBank已公布的约克夏、汉普夏、杜洛克、梅山猪、藏猪、广西巴马小型猪的基因同源性均在99.8％以上.陆川猪MSTN因第294位点存在特有的碱基G,但未引起氨基酸改变.蛋白质二级结构预测结果表明,陆川猪的MSTN成熟肽包含有α螺旋、β转角、延长线和无规卷曲4种二级结构元件.[结论]猪MSTN因高度保守,可作为研究陆川猪肌肉生长发育和脂肪沉积的候选基因之一.     

肉牛肌生成抑制素成熟蛋白编码序列的克隆与原核表达

[目的]原核表达肉牛肌生成抑制素成熟蛋白编码序列基因并进行功能验证,为后期的小鼠接种实验打下基础。[方法]采用RT-PCR方法扩增肉牛MSTN成熟蛋白编码序列基因,该扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体pET28a（＋）中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blot检测重组目的蛋白的表达结果。[结果]经Anti-His-Tag鉴定正确。[结论]肉牛MSTN成熟蛋白编码序列基因在原核表达系统中得到正确表达。     

肌肉生成抑制素(MSTN)基因及其在畜牧业上的应用

肌肉生成抑制素(Myostatin,MSTN)是控制肌肉生长的负调控因子,属于TGF-β超家族成员,是影响畜禽瘦肉率、改善肉质性状的重要营养基因。文章主要对MSTN基因的结构、基因表达、生物学功能及其在畜禽生产中的应用进行综述。     

湖北白猪IGF-I基因的克隆及序列分析

[目的]以湖北白猪肝脏作为试验材料,克隆出湖北白猪胰岛素生长因子（IGF-I）基因,并对其序列进行分析。[方法]采用Trizol法从湖北白猪的肝脏中提取总RNA,将其作为RT反应的模板,用P2（5＇-CAGGTAACTCGTGCAGAGCAAAGGA-3＇）引物合成IGF-I基因cDNA第一链,以其产物为模板,再以P1（5＇-CCCATCTCCCTGGATTTCTTTTTG-3＇）和P2为上下游引物扩增到大小约为607 bp的产物,并将其克隆至pCRII载体上,经蓝白斑筛选、酶切、测序。[结果]经筛选、酶切、序列分析,表明该片段为IGF-I基因的cDNA克隆,它由607个核苷酸组成,其中1～145位是5＇端非翻译区,从第146位ATG起始密码子开始至第538位TAG终止密码子5,39～607位是3＇端非翻译区,包含一完整的ORF,该ORF共有393核苷酸,编码一个推断由130个氨基酸组成的多肽。与GenBank中的序列比较,该序列与Muller等报道的猪IGF-I基因编码序列完全同源。[结论]成功克隆了湖北白猪IGF-I基因,并对其进行序列分析,证实了IGF-I基因的高度保守性,为采用转基因技术对湖北白猪进行育种奠定了基础和提供了技术依据。     

湖北白猪IGF-1基因的克隆及序列分析

[目的]以湖北白猪肝脏作为试验材料,克隆出湖北白猪胰岛素生长因子（IGF-1）基因,并对其序列进行分析。[方法]采用Trizol法从湖北白猪的肝脏中提取总RNA,将其作为RT反应的模板,用P2（5＇-CAGGTAACTCGTGCAGAGCAAAGGA-3＇）引物合成IGF-1基因cDNA第一链,以其产物为模板,再以P1（5＇-CCCATCTCCCTGGATTTCTTTTTG-3＇）和P2为上下游引物扩增到大小约为607bp的产物,并将其克隆至pCRII载体上,经蓝白斑筛选、酶切、测序。[结果]经筛选、酶切、序列分析,表明该片段为IGF-1基因的cDNA克隆,它由607个核苷酸组成,其中1～145位是5＇端非翻译区,从第146位ATG起始密码子开始至第538位TAG终止密码子,539～607位是3＇端非翻译区,包含一完整的ORF,该ORF共有393核苷酸,编码一个推断由130个氨基酸组成的多肽。与GenBank中的序列比较,该序列与Muller等报道的猪IGF-1基因编码序列完全同源。[结论]成功克隆了湖北白猪IGF-1基因,并对其进行序列分析,证实了IGF-1基因的高度保守性,为采用转基因技术对湖北白猪进行育种奠定了基础和提供了技术依据。     

湖北白猪胃蛋白酶原A基因cDNA克隆与序列分析

根据Genebank公布的J04601猪胃蛋白酶原A序列,进行了引物的设计和筛选,通过RT-PCR获得了湖北白猪的胃蛋白酶原A的cDNA序列全长,共1 227 bp(已提交Genebank,登录号EF108301),其具有一个长度为1 158 bp的读码框,编码385个氨基酸,其中包含15个氨基酸组成的信号肽,成熟的胃蛋白酶原A由370个氨基酸残基组成.与J04601比较,核苷酸和氨基酸相似性分别为99.3%和98.7%.经PredictProtein分析表明,核苷酸和氨基酸的改变没有造成蛋白质二级结构和功能的变化;并对胃蛋白酶原A基因密码子使用频率和mRNA的二级结构进行了分析,为其载体和宿主的选择以及基因的改造奠定了分子生物学基础.     

猪肌肉生长抑制素基因5''''-调控区的突变与生产性能的相关分析

生长性状是猪育种中选择的主要目标性状之一。研究影响生长速度的基因或QTL具有重要的实践意义和理论价值。运用PCR-SSCP技术对猪肌肉生长抑制素基因(myostatin)5′-调控区的突变与部分生产性能(初生重和断奶重)的关系进行了分析。结果表明:MSTN基因型对初生重影响显著,对断奶重影响不显著。     

东北马鹿Myostatin基因编码序列的克隆及序列分析

根据Myostatin基因的保守性,选择牛(Bos taurus cattle登录号:AB076403)的Myostatin序列为模板进行引物设计,首次从东北马鹿基因组中扩增出Myostatin序列,扩增产物连接pMD18-T载体,克隆出3个外显子片断。根据5-′GU-AG-3′规则和同源基因比对拼接出完整的编码序列,全长为1 128 bp(发表到GenBank登录号:EF629535),Myostatin蛋白前体由375个氨基酸组成。同源比较结果表明:Myostatin在进化过程中具有高度保守性,东北马鹿与猪Myostatin编码序列同源性最高达到98%,鸟类与哺乳动物间Myostatin编码序列同源性为85%~89%,鱼类与其他动物间编码序列同源性为60%~67%。Myostatin编码序列能够真实反映远缘物种的进化关系,可以作为远缘物种进化分析较理想的标记。     

湖北白猪优质系生长肥育和胴体性能研究初报

采用湖北白猪优质系,选取自杂交一代开始到第三世代各阶段共379头猪只的生长肥育资料和75头猪只的屠宰测定资料,进行了生长肥育和胴体性能的初步分析.结果表明,湖北白猪优质系90kg左右体重的屠宰率可达75%,瘦肉率可达59%,肌内脂肪含量也在3%以上,说明选育群生长肥育性能还需要进一步提高.分析表明,湖北白猪优质系的结束体重与结束日龄、全期日增重、背膘厚和前期日增重有较大程度的相关,相关系数分别为0.59、0.53、0.35和0.31;屠宰体重与屠宰率和眼肌面积相关程度较高,相关系数分别为0.39和0.33.与瘦肉率、脂率、板油率和肌内脂肪的相关系数分别为0.19、0.22、0.18和0.21:瘦肉率与脂率、板油率、胴体膘厚和肌内脂肪有较高的负相关,相关系数分别为-0.80、-0.66、-0.47和-0.35,与眼肌面积有较高的正相关,相关系数为0.58,这提示选育工作要注意兼顾瘦肉率和肌内脂肪的选择.结果还表明,湖北白猪优质系的最适上市体重为90 kg.     

岭南黄鸡肌生长抑制素基因成熟肽的克隆及酵母表达质粒的构建

根据Genebank上登录的鸡的myostatin基因cDNA全长序列以及成熟肽序列设计一对引物,并分别在两引物前设计两个酶切位点EcoRⅠ和KpnⅠ,克隆岭南黄鸡肌肉生长抑制激素的成熟肽蛋白编码基因,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定后,构建了岭南黄鸡真核单纯表达载体pPICZαA-MSTN-m,经测序鉴定,结果表明所克隆的myosta-tin成熟肽基因与Genebank上发表的鸡（AF019621）、猪（AY208121）和家鹅（AF440862）的MSTN-m核酸序列同源性分别可达到99%、92%、86%,但翻译后的成熟蛋白氨基酸序列与鸡、猪和家鹅的同源性可以分别达到100%、99.1%及99.1%。     

湖北白猪Ⅴ,Ⅵ系配套杂交利用的研究

以湖北白猪Ⅱ系、Ⅴ系、Ⅵ系为母体,以杜洛克、大白猪、长白猪、施格猪为父本,开展了白猪Ⅴ、Ⅵ系配套杂交利用研究。通过肥育性能和胴体性能测定,结果表明：大Ⅴ、大Ⅵ两配套组合优于其它组合,两配套母系７５日龄至９０ｋｇ平均日增重分别为７１２．５ｇ、７０９ｇ,与湖北白猪Ⅴ、Ⅵ系相比分别提高１４．８４％（Ｐ〈０．０１）、１５．４５％（Ｐ〈０．０１）,与施Ⅴ、施Ⅵ、长Ⅱ相比差异极显著（Ｐ〈０．０１）;达９０ｋｇ     

荣昌猪白细胞介素-8基因cDNA的克隆及序列分析

从体外ConA刺激20 h的荣昌猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增,pMD18-T载体连接,常规转化后,进行酶切及序列测定,并进行鉴定。结果显示:猪IL-8基因与人、猕猴、牛、绵羊和家犬基因序列的同源性分别为81.3%、80.4%、88.9%、88.2%和85.3%。