龙眼SRAP反应体系的建立和优化

采用分步优化的方法对影响龙眼SRAP-PCR反应的模板DNA用量、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、TagDNA聚合酶用量等进行了研究。确立了适合龙眼SRAP分析的反应体系,即体系总体积25μl,包含1×PCR Buffer ,Mg2+ 2.0mmol/L,dNTPs 0.5 mmol/L,引物0.3μmol/L,模板DNA 10ng, TaqDNA聚合酶1.5 U。结果表明,该体系能很好地满足龙眼基因组SRAP扩增的要求,SRAP标记应用于龙眼遗传研究是可行的。     

稀土元素对植物生物学作用机制的研究进展

稀土元素在农业上得到了广泛的应用,产生了显著的经济效益。人们对稀土元素生物学效应的作用机制进行了很多研究,提出了许多论点。从稀土元素在植物体内的赋存、稀土元素对植物光合作用的影响机制、稀土元素对细胞中Ca的竞争取代机制、稀土元素对生物体内自由基的清除机制和稀土与生物大分子的紧密结合及在细胞水平的定位五个方面综合分析了稀土元素对于植物体作用机制的最新研究成果,为稀土农用技术的研究提供新的思路。     

文冠果ISSR反应体系的建立及优化

为了建立文冠果ISSR-PCR最佳反应体系,从而为文冠果遗传多样性研究提供理论依据,从定西巉口林场文冠果人工林内选取健康嫩叶为试验材料,通过单因子试验研究了影响ISSR-PCR反应各因素的浓度,分析因子包括模板DNA用量、退火温度、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度及TaqDNA聚合酶用量等。通过研究,找出了各因子合适的条件,建立并优化了文冠果ISSR反应体系,即20μL总反应体系含模板DNA约30 ng,Mg²⁺2.5 mmol/L,引物0.2μmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,Taq聚合酶1 U。试验结果表明,在此反应体系下可得到多样性好、条带清晰的图谱。     

芦笋ISSR反应体系的建立及优化

通过正交试验建立芦笋ISSR优化反应体系,并对其反应程序进行优化。实验结果表明,优化的扩增体系:25μL的反应体系中含150 ng的模板DNA、0.3μmol/L引物、15μL 2×Mastermix;优化的反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,设定温度退火60 s,72℃延伸45 s,循环30次;然后72℃延伸10 min,4℃保存;筛选到了21条引物并确定其最优退火温度。实验结果为芦笋资源遗传多样性评价的研究奠定基础。     

舞毒蛾ISSR反应体系的优化与建立

舞毒蛾是一种食性广、危害大的林业害虫,遗传多样性的研究有利于揭示不同地理种群的遗传变异情况。以河北舞毒蛾为实验材料,对ISSR反应体系中的5个因子（Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物、MgCl2和dNTPs）的8个浓度梯度依次进行试验,每一因子的最佳浓度都用于下一组优化试验,最终确定最佳反应体系优化筛选,结果表明,20μL ISSR反应体系各组分的最适浓度分别为0.5 U Taq DNA聚合酶,1.5 ng/μL模板DNA,2.4μmol/L引物,1.75 mmol/L MgCl2,0.28 mmol/L dNTPs。这一优化的舞毒蛾ISSR-PCR反应体系为进一步利用ISSR分子标记技术对舞毒蛾的遗传多样性分析奠定了良好的试验基础。     

毛花猕猴桃种质资源ISSR反应体系的建立和优化

以毛花猕猴桃种质资源为试验材料,通过正交实验设计对影响ISSR反应体系各个主要因素进行优化。研究结果表明,最佳ISSR-PCR反应体系为:总体积为20μL,2μL buffer(无Mg2+),1 mmol/L Mg2+,1 U Taq酶,0.25 mmol/L d NTPs,1μmol/L引物,80 ng模版DNA;扩增程序为94℃3 min;94℃30 s,50℃~60℃退火45 s,72℃1 min(40个循环);72℃7 min,12℃保存;引物UBC842的最佳退火温度为58℃。利用该体系,用引物UBC835对46份野生毛花猕猴种质资源进行扩增,扩增结果表明建立的ISSR-PCR反应体系重复性好,稳定性强。     

川续断ISSR反应体系的建立与优化

利用两轮混合均匀设计的方法,研究引物、2×Taq master mix、模板DNA以及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响,在此基础上获得优化的川续断ISSR反应体系,为后续开展川续断的遗传多样性分析奠定基础。试验显示川续断ISSR-PCR最佳反应体系为:在18μL的反应体系中含有2×Taq Master Mix 10.44μL,模板DNA 45 ng,引物0.35μmol/L。在此基础上,从100条引物中筛选出5条扩增较稳定、多态性丰富的引物,随后进行的温度梯度PCR实验发现引物最佳退火温度介于45℃~58℃之间。该试验表明采用混合均匀设计和单因素试验相结合的方法,可以减少实验处理次数,快速建立ISSR反应体系,经过对9份川续断种质资源进行ISSR扩增检测,证明该体系稳定可靠,可用于川续断遗传多样性分析。     

杏ISSR反应体系的建立

为建立杏适宜的ISSR反应体系,以红玉杏为试材,探讨影响ISSR扩增的主要因素包括模板浓度、MgCl2浓度、dNTPs浓度、引物浓度及循环次数。通过筛选及优化,确定杏ISSR的适宜扩增条件。结果表明,在25 μl PCR反应体系中,各组分的适宜浓度配比为：模板1 μl（40 ng）、dNTPS 2.5 μl（2.5 mmol/L）、Taq DNA聚合酶0.5 μl（2.5 U）、引物1 μl（20 μmmol/L）、10×PCR Buffer 2.5 μl、MgCl2 2.5 μl（2.5 mmol/L）、ddH2O 15 μl,反应循环次数40次。同时利用建立的ISSR反应体系对3种普通杏品种进行扩增,证明该体系完全适合此标记对杏不同品种的遗传分析,从而为下一步杏资源遗传多样性的研究提供理论依据和参考价值。     

缘毛雀麦ISSR—PCR反应体系的建立和优化

以缘毛雀麦基因组DNA为模板,对ISSR反应体系中的一些重要参数进行探索和优化试验,初步建立了一套雀麦属牧草ISSR分析的优化反应体系及反应程序.在20μl反应体系中,含有2.0 mmol/L Mg2+、2.0 U Taq酶、O.3 mmol/L dNTP、0.5/μmol/L引物和30 ng模板DNA.反应程序:第1个循环,基因组DNA经94℃预变性5 min;45个循环为94℃变性45 S,54℃退火60 s,72℃延伸90 s;最后1个循环完成后,在72℃下延伸7 min.     

丝瓜ISSR反应体系的优化

以丝瓜基因组DNA为模板,对ISSR反应中主要5个影响因素Mg~(2+)浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度和DNA模板浓度,建立丝瓜ISSR-PCR反应的体系。根据实验确定的最佳反应体系为:25μL ISSR体系:50 ng DNA,0.2 mmol/L dNTP,1 U Taq酶,0.4μmol/L的单条引物,2.5μL 10×Buffer,2.0 mmol/L Mg~(2+)。在此基础上,对12个引物的退火温度进行优化。最终选用60份丝瓜品种对所确定的扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、亮度高和重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于丝瓜的ISSR分子标记为丝瓜种质资源的鉴定、分类和丝瓜的杂交育种提供参考依据。     

柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系的建立与优化

通过对PCR反应程序、反应体系(DNA模板量、PCR反应体积、Mg2 浓度、dNTP浓度、Taq酶用量、引物量)、电泳检测方法的系统优化,建立了柑桔SRAP-PCR和ISSR-PCR体系;以此进行大规模引物筛选,从而建立了柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系.SRAP-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10 mmol/L,KCl50 mmol/L,Mg2 1.2 mmol/L,dNTP 120 μmol/L,Taq酶1.5U,引物0.4μmol/L,反应程序为94℃预变性5min,35个循环(94℃ 30s,47℃ 1min,72℃ 1min),72℃延伸10min;ISSR-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10mmol/L,KCl50mmol/L,Mg2 1.6 mmol/L,dNTP200μmol/L,Taq酶1 U,引物0.8μmol/L.筛选出稳定性好、多态性高的24对SRAP引物和13条ISSR引物.     

龙眼采后腐烂相关细菌与真菌的分离与鉴定

采用稀释涂布平板法,从龙眼腐烂果实中分离细菌和真菌,并结合菌落形态观察以及16S rDNA和ITS序列分析对所分离的细菌和真菌进行鉴定。结果表明,采用稀释涂布平板法,从龙眼腐烂果实中分离得到11株细菌和7株真菌。菌落形态观察以及16S rDNA和ITS序列分析结果表明,所分离的细菌主要鉴定为奥斯陆莫拉菌、短小芽胞杆菌、柠檬明串珠菌、肠膜状明串珠菌和东方醋酸菌。所分离的真菌主要鉴定为淡色生赤壳菌、葡萄座腔菌科真菌、间座壳菌、疖葡萄座腔菌和木贼镰孢菌。从龙眼腐烂果实中分离到的细菌和真菌目前在龙眼采后病害中未见相关报道,对于其致病性检测还有待于进一步的回接验证,以明确导致采后龙眼果实腐烂的主导微生物。     

梨属植物ISSR技术体系的建立与优化

本研究以雪花梨为材料,对ISSR反应体系中的模板用量、引物浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶用量等一些重要参数进行探索和优化,初步建立了稳定的具有广泛适用性的梨属植物ISSR技术的反应体系及扩增程序,即20 μL体系中含1×buffer (内含1.5 mmol? L-1 MgCl2)、模板DNA 40～60 ng、引物浓度为0.2 μmol?L-1、 dNTP 200 μmol?L-1、Taq DNA聚合酶 1U。扩增程序为：94℃ 5 min、退火60s、72℃延伸120 s,然后连续39个循环为94℃ 60s、退火温度(52℃左右)60s 、72℃延伸120s,完成最后一个循环后,在72℃继续延伸10 min,然后在4℃保温,最后通过1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物。     

40个龙眼品种(品系)DNA指纹图谱构建及遗传关系分析

有效鉴别龙眼新品种（品系）,为龙眼种质资源研究和新品种保护提供理论基础。利用ISSR分子标记分析‘冬宝9 号’、‘高宝’等4 个龙眼新品种（品系）与36 个龙眼品种的遗传关系,并建立其DNA指纹图谱。从80 个ISSR 引物中筛选出11 个多态性好、扩增清晰的引物。结果显示,11 个引物共获得146个位点,有125 个多态性位点,多态性百分率为85.7%。40 个龙眼品种（品系）的遗传相似系数在0.58~0.88 之间。UPGMA聚类结果表明,40 个龙眼品种（品系）在遗传相似系数为0.64 的水平处划分为3 组。引物UBC810/UBC818 组合可将40 个龙眼品种（品系）全部区分开,并依此建立了数字化的DNA指纹图谱,为龙眼新品种的鉴别、分类、示范及推广等方面提供依据。     

正交优化设计天冬ISSR反应体系的研究

根据正交试验设计的原理,设计了探索性正交试验和精致正交试验。以Mg^2＋、dNTP、引物和TaqDNA酶浓度4种因素3个水平对天冬ISSR-PCR反应体系进行研究,得到适合天冬的20μl最佳反应体系：1×PCR buffer,1.75mmol／L Mg^2＋,200μmol／L dNTPs,0.3／zmol／L引物,1.2U TaqDNA酶,50ng模板DNA。为今后利用ISSR标记技术研究天冬的遗传多样性打下基础。     

款冬花DNA提取及ISSR体系优化

摘 要：为了从分子水平对款冬种质资源进行鉴定和遗传多样性分析,分别采用SDS法、CTAB法、改良SDS法和改良CTAB法提取款冬叶片基因组DNA,比较不同方法的提取效果,并用改良CTAB法提取的DNA进行ISSR-PCR扩增体系摸索,建立优化的ISSR-PCR反应体系。结果显示：改良SDS法和改良CTAB法都可以提取出高质量的DNA,最优的ISSR-PCR反应条件为: 20μl反应体系中含DNA模板约20ng,Taq 酶1.0 U,Mg2+ 2.00 mmol/L,dNTPs 0.20 mmol/L,引物0.6 μmol/L,1×PCR缓冲液。     

石斛属植物ISSR扩增体系的建立与优化

旨在建立并优化石斛属植物的ISSR-PCR反应体系。通过对ISSR-PCR反应体系中主要影响因子模板DNA、dNTP、10×PCR Buffer、引物以及Taq DNA聚合酶分别进行单因素优化,最终建立一套适用于石斛属植物的扩增多态性高、稳定性强、带型清晰的ISSR最佳反应体系。20μL反应体系的适宜浓度及用量分别为：模板DNA 10 ng/μL 3μL,dNTP 2.5 mmol/L 1.5μL,10×PCR Buffer 3.0μL,引物4μmol/L 3.5μL,TaqDNA聚合酶5 U 0.2μL。这一优化体系适用于石斛ISSR分析,为今后遗传多样性与亲缘关系分析、连锁图谱构建、QTL定位、基因定位与克隆等方面的研究提供了技术支撑。     

正交设计优化黄瓜ISSR体系

黄瓜是一种重要的蔬菜作物,品种资源较为丰富,利用分子标记进行黄瓜资源鉴定和分类、构建分子遗传图谱和基因定位方面已取得一定进展,目前应用的分子标记主要包括RAPD、AFLP和SSR,尚未见有关于ISSR标记在黄瓜上的研究报道。ISSR主要是由单一引物且以重复序列为主要引物序列的PCR标记,其反应条件受模板DNA、TaqDNA聚合酶、Mg2 、dNTPs和引物等因素的影响。正交试验设计能明确各因素间的互作效应,建立最优化的反应体系。本研究利用这一方法,从Taq酶、dNTPs、引物、Mg2 4种因素各3个水平来优化黄瓜ISSR反应体系。通过实验,在25μl反应体系中初步确定各反应成分为:1×PCRbuffer,1.5mmol/LMg2 ,25ng黄瓜模板DNA,ddH2O,1UTaq酶,200μmol/LdNTPs,0.75μmol/L引物。这一体系的建立为今后利用ISSR技术进行黄瓜种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

彩色马蹄莲ISSR体系的建立及初步分析

选取白花马蹄莲和10个颜色有代表性的彩色马蹄莲栽培品种为材料,采用改进的SDS法提取叶片基因组DNA,通过正交设计研究Mg2+、Taq DNA聚合酶和模板DNA、引物的影响,确定彩色马蹄莲最佳ISSR反应体系为:每20μL中含1×PCR Buffer、1.5 mmol/L MgCl2、0.6μmol/L引物、20 ng模板DNA、1 UTaqDNA聚合酶.从100个引物中筛选出的15条进行分析,共获得了109条带,其中多态性为99条,占总数的90.8%.选用NTSYS软件进行聚类分析,绘出了供试材料的亲缘关系图,为系统进行马蹄莲属植物的遗传多样性分析和品种选育提供了参考.