杉木CCoAOMT基因部分cDNA克隆与序列分析

利用CODEHOP设汁CCoAOMT基因的简并引物,通过RT-PCR的方法,从杉木茎段中克隆到1个长度为614 bp的PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,序列通过同源性比对后显示该片段与其它植物的CCoAOMT基因具有较高的同源性.利用生物信息学方法分析发现,该序列在112～651 bp片段上有一个开放性阅读框,该序列编码的是一个酸性蛋白,亲水性较弱.疏水性较强;信号肽序列为第23位至第45位,二级结构以α-螺旋(40.62%)与不规则盘绕(45.31%)为主,没有发现β转角区域.     

油茶ACP基因的全长cDNA克隆及序列分析

酰基载体蛋白是脂肪酸合成中的关键蛋白质,位于脂肪酸合成酶系的中央,作为脂酰基的载体将脂酰基从一个酶反应转移到另一个酶反应.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为基础,采用分子生物学技术分离克隆了油茶酰基载体蛋白基因全长cDNA序列.结果表明：油茶酰基载体蛋白基因的全长cDNA为669bp,包含1个完整的CDS及3′UTR和5′UTR,编码141个氨基酸,该基因被命名为co-acp并提交至GeneBank,登录号是EU717697;油茶酰基载体蛋白基因的推导氨基酸序列与其它15种植物的ACP进行AlignX比较的结果表明,油茶酰基载体蛋白与油橄榄ACP的相似性最高,而且遗传距离最近;预测油茶酰基载体蛋白的二级结构以α螺旋为主,没有跨膜结构域和信号肽,其等电点约为4.995.     

油桐LEC1基因的cDNA克隆与序列分析

为了解LEC1(Leafy Cotyledon 1)基因对油桐油脂合成过程的调控机理,以油桐种仁转录组数据库中基因的部分c DNA序列为基础,采用RT-PCR技术从油桐种子中克隆LEC1基因的全长c DNA,并对其进行序列分析。油桐LEC1基因全长c DNA为1 152 bp,编码区为729 bp(142~870),编码243个氨基酸,5′端非编码区和3′端非编码区分别为141 bp和263 bp。该基因编码蛋白质的相对分子质量为27 025.4 Da,理论等电点为6.97;蛋白二级结构以不规则卷曲和α螺旋为主,是不具有跨膜结构的膜外蛋白。经对比发现,油桐LEC1具有典型的HAP3结构特点,在不保守的N端和C端中间有1个十分保守的结构域,与拟南芥、玉米、麻风树、黄连木等的LEC1氨基酸序列高度同源。     

赤桉FAD2基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析

桉树是世界上重要的多功能树种,从桉叶中提取的桉叶油含有不饱和脂肪酸,对于桉叶油的药用活性和桉树的抗逆性具有重要的作用。为深入了解桉树的不饱和脂肪酸的生物合成途径和分子调控机理,本研究根据FAD2基因的保守区段设计兼并引物,从赤桉嫩叶中获得了一条FAD2基因的片段,并进一步利用RACE技术得到了此基因的全长cDNA,将其命名为EC-FAD2基因。通过生物信息学分析发现,该基因全长cDNA为1 472 bp,编码389个氨基酸,并且具有FAD2蛋白特有的保守序列和相关特征。经过比对分析,发现赤桉的FAD2蛋白与其他植物的FAD2蛋白具有较高的相似性。     

油茶FatB基因全长cDNA的分离克隆及序列分析

以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE等技术,获得了油茶FatB基因的全长cDNA克隆。RACE测序结果表明:油茶FatB基因不是一个单基因,而是一个多基因家族;用生物信息学的方法预测各RACE片段的起始密码子和终止密码子的位置,在起始密码子上游和终止密码子下游分别设计RT—PCR引物,RT—PCR扩增结合随机测序、生物信息学分析,分离克隆出5个基因家族成员,分别命名为co—fatb1、co—fatb2、co—fatb3、co—fatb4、co—fatb5,其全长CDS为1 272、1 311、1 305、1 305、1 263 bp,将上述基因序列提交至GenBank,登录号分别为FJ899670、FJ899671、FJ899672、FJ899673、FJ899674;最后,对油茶FatB的氨基酸序列的特殊位点进行了标识和分析。     

油茶SAD基因的全长cDNA克隆及生物信息学分析

油茶( Camellia oleifera )是原产于我国的重要木本油料树种,广泛分布于我国南方,总面积达350万hm 2,种仁含油率约为55%.所产茶油富含90%以上的油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸,还含有少量的亚麻酸等高价不饱和脂肪酸(胡芳名等,2006),是易消化耐贮藏的优质食用植物油,其油质甚至一定程度上优于橄榄油.     

杨树木质素合成酶hct基因的克隆及核苷酸序列分析

根据毛果杨全序列（AC185363.2）中唯一具有转移酶功能的保守区设计引物,以正在分化的2年生欧美杨107次生木质部总RNA为模板经RT-PCR扩增出hct基因片段,与pMD20-T载体连接,重组质粒经特异引物扩增、限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果表明,扩增片段长度为709bp,包含一个708bp的开放阅读框,与毛果杨全序列及HCT2（EU603314）的同源性均为98%,编码的氨基酸序列与毛果杨HCT2氨基酸（ACC63883.1）的同源性为98%,断定我们克隆的cDNA为hct,属于转移酶超家族,GenBank登录号为FM202091,该重组质粒命名为pMD20-T-hct。     

杉木木质素合成酶基因CCR的克隆和序列分析

以杉木(Cunninghamia lanceolata)茎叶为材料,根据已报道的肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)基因保守区设计简并引物,采用RT-PCR结合RACE的策略克隆获得杉木CCR基因的全长cDNA(命名为CLCCR),该基因cDNA序列全长1 379 bp,具有一个975 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,简称ORF),编码324个氨基酸,序列分析表明:杉木CCR基因核苷酸序列与已报道的欧洲云杉(Picea abies,CAK18610.1)CCR基因具有87%的相似性;与其他植物氨基酸序列聚类分析显示杉木与松科植物欧洲云杉、马尾松(Pinus massoniana)、火炬松(P.taeda)的亲缘关系较近。     

油桐油体蛋白基因的克隆及序列分析

油桐油体蛋白与油桐脂肪酸储藏密切相关。通过构建油桐cDNA文库和EST文库,用分子生物学手段分离克隆出两个油桐油体蛋白基因的全长cDNA序列。通过分析表明,两个油体蛋白基因的全长cDNA分别为738 bp、838 bp,各包含1个完整的CDS,分别编码137个、154个氨基酸。分别命名为VF_oleⅠ,VF_oleⅡ。通过与其它物种的19条油体蛋白氨基酸序列比对,油桐油体蛋白基因分别与麻疯树oleosin 3和麻疯树oleosin 2的相似性最高,分别为84%、82%。通过软件预测表明,油桐油体蛋白等电点分别为10.315、10.335,都存在跨膜结构域,且存在信号肽剪切位点,中部都存在一个较长的疏水区,C末端都是以α-螺旋为主。     

日本落叶松 UDPGDH基因的cDNA克隆和表达分析

以日本落叶松杂交Solexa转录组测序获得的数据为依据,经拼接后获得尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UDPGDH)原序列,以该序列两端设计引物,在落叶松亲代和子代幼嫩针叶中成功克隆了UDPGDH基因cDNA序列,序列长1 443 bp,编码480个氨基酸。qRT-PCR结果分析表明:UDPGDH基因的表达量在落叶松杂交子代中远远高于亲本,正交子代的表达比反交子代高,说明UDPGDH在形成细胞壁半纤维素前体物过程中起着非常重要的作用,暗示UDPGDH在子代的高表达有利于杂种优势的形成。     

绵毛优若藜冷诱导SSH文库构建研究

绵毛优若藜是我国近年成功引种的高抗逆性饲用及防风固沙植物。以常温下的绵毛优若藜叶片和嫩枝为对照组,冷胁迫诱导处理后的叶片和嫩枝为试验组,获得两者高质量mRNA后反转录成cDNA,RsaI消化使其平末端化,试验组cDNA的5’末端连接上2个特异接头,然后分别与过量对照组cDNA进行杂交,把两份杂交样品混合后,与过量的新鲜变性的对照组cDNA过夜杂交,杂交后的混合液稀释后进行第一轮抑制性PCR以选择扩增特异表达的cDNA,然后以第一轮PCR产物为模板用巢式引物进行二次抑制性PCR,获得的富集差异表达cDNA即为绵毛优若藜冷胁迫SSH文库。将SSH文库的cDNA插入到载体中,共获得了362个克隆,为后续绵毛优若藜的抗冻基因克隆与转基因应用奠定了基础。     

油桐ALDH22A1和ALDH2C4基因克隆及其序列分析

为给油桐ALDH基因的结构与功能研究提供理论依据,以葡萄桐的近成熟种子为材料,根据油桐转录组测序结果设计引物,采用RT-PCR技术克隆了油桐ALDH22A1基因和ALDH2C4基因的全长cDNA序列。ALDH22A1的cDNA序列全长1 782 bp,编码593个氨基酸,该基因编码蛋白质的相对分子质量为65.60 kDa,理论等电点为6.62,蛋白二级结构以α螺旋为主,具有1个明显的跨膜结构,是稳定的非分泌蛋白。ALDH2C4的cDNA序列全长1 506 bp,编码501个氨基酸,该基因编码蛋白质的相对分子质量为54.82 kDa,理论等电点为6.58,蛋白二级结构以α螺旋为主,是不具有跨膜结构的膜外蛋白。BLASTp分析结果表明,这2个基因所编码序列与麻疯树、蓖麻的乙醛脱氢酶一致性最高,高达80%以上,含有醛脱氢酶基因家族的保守结构域。     

马尾松苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase,PAL)是苯丙烷类代谢的关键酶,催化苯丙氨酸转化为肉桂酸,促进黄酮、木质素等次生代谢产物的合成。根据其他植物PAL基因的DNA保守序列设计的简并引物,经过PCR扩增,得到1条864 bp的特异性片段,编码288个氨基酸。通过分析其序列和编码的氨基酸序列,发现其与其他物种的PAL基因高度同源,证实为马尾松PAL基因的核心序列。所得序列已经登陆在NCBI的Genbank中,序列号为GQ142010。     

Expression of a carrot 36 kD antifreeze protein gene improves cold stress tolerance in transgenic tobacco

Antifreeze proteins （AFPs） enable organisms to survive under cold conditions, and have great potential in improving cold tolerance of cold-sensitive plants, In order to determine whether expression of the carrot 36 kD antifreeze protein gene confers improved cold-resistant properties to plant tissues, we tried to obtain transgenic tobacco plants which expressed the antifreeze protein. Cold, salt, and drought induced promoter Prd29A was cloned using PCR from Arabidopsis. Two plant expression vectors based on pBI121 were constructed with CaMV35S：AFP and Prd29A：AFP. Tobacco plantlets were transformed by Agrobacterium-medicated transformation. PCR and Southern blotting demonstrated that the carrot 36 kD afp gene was successfully integrated into the genomes of transformed plantlets. The expression of the afp gene in transgenic plants led to improved tolerance to cold stress. However, the use of the strong constitutive 35S cauliflower mosaic virus （CaMV） promoter to drive expression of afp also resulted in growth retardation under normal growing conditions. In contrast, the expression of afp driven by the stress-inducible Prd29A promoter from Arabidopsis gave rise to minimal effects on plant growth while providing an increased tolerance to cold stress condition （2℃）. The results demonstrated the prospect of using Prd29A-AFP transgenic plants in cold-stressed conditions that will in turn benefit agriculture.     

Full length cDNA cloning and expression analysis of annexinA2 gene from deer antler tissue

ANXA2（AnnexinA2）, a calcium-dependent phospholipid bind- ing protein, is involved in various Ca2＋-related biological activities. In the present study, full-length cDNA of ANXA2 was isolated from the velvet antler tip tissue of sika deer （Cervus nippon hortulomm）; the amino acid sequence and gene expression was analyzed by using bioinformatics and real-time reverse transcdptase polymerase chain reaction （RT-PCR） techniques. Nucleotide sequence analysis reveals that the full-length cDNA of the ANXA2 gene was 1372 bp, of which 1020 bp was in the opan-reading frame （OR.F） encoding 339 amino acids; its relative mo- lecular weight was 38.3 kDa; and isoelectrie point was 6.72. Sequence analysis indicates that the protein includes four conserved tan- dem-duplication ANX domains. The gene-aceession nucleotide sequence number in GenBank is JX315571. Expression analysis by RT-PCR re- veals that ANXA2 gene expression has a significant positive correlation with the antler-tissue mineralization process, indicating that this gene may play an important role in the regulation of antler-tissue mineraliza- tion.     

黄芪鲨烯合酶基因的克隆和序列分析

参照豆科其他植物的鲨烯合酶基因序列设计了引物,通过逆转录PCR方法,从荚膜黄芪（Astragalus mem-branaceus（fish.）Bge）中克隆了鲨烯合酶基因cDNA序列（GenBank登录号HQ829974）。通过BLAST发现黄芪鲨烯合酶推测的氨基酸序列与大豆鲨烯合酶（BAA22559.1）序列相似性最高,达到了88%。黄芪鲨烯合酶的克隆为以后通过基因转化提高黄芪皂苷含量亦或通过生物工程手段生产黄芪皂苷打下基础。