蛋白质体外进化建库技术研究

蛋白质体外进化技术是蛋白质工程发展的一个里程碑,也是改造蛋白质的一种有效工具。它不仅具有重要的应用价值,而且有助于蛋白质结构与功能的研究。通过蛋白质体外进化技术已成功地改造了许多蛋白质,有些已应用于工农业生产。体外进化技术分为两步：建库和筛选。本文主要对蛋白质体外进化策略及对体外随机突变技术、DNA重组技术、利用活细胞自身修复系统构建突变文库等几种定向进化突变文库建立技术进行了介绍与论述,同时还对蛋白质体外进化技术的应用及与其它学科结合的研究前景进行了分析,为获得具有改进功能或全新功能的蛋白质提供理论基础。     

酶的分子定向进化及其应用

酶的分子定向进化是20世纪90年代初兴起的一种蛋白质工程的新策略,是一种在生物体外模拟自然进化过程的、具有一定目的性的快速改造蛋白质的方法。该方法引起了生物催化技术领域的又一次革命。目前分子定向进化技术已被广泛应用于工业、农业及制药业等的相关领域。本文详细综述了酶的分子定向进化的概念、过程、基本策略及其核心技术,并着重介绍了酶的分子定向进化技术在提高酶的活力、稳定性、底物特异性和对映体选择性等几方面的应用及取得的相关成果。     

代谢谱技术及其在水稻研究中的应用

代谢谱技术是指某一个代谢途径中超过一个基因被干扰后,对该途径中的某种特定的代谢产物进行定量分析.代谢谱技术已被广泛用于品种分类与真实性鉴定、基因功能、代谢调控与系统生物学研究、转基因农作物的安全性评价等方面,并在农作物成分改良方面具有广阔的应用前景.代谢谱技术最早主要用于拟南芥的研究,在水稻中的应用目前相对较少.本文主...     

植物根际微生物调控根系构型研究

植物根系构型即根系在其生长介质中的生长与分布,包括根系长度、根系分支和根系生物量等,能够将植物固定在土壤中并有效吸收水分和矿质养分,直接影响植物的生长和发育。根系构型受多种因素的影响,包括土壤水分、养分和根际微生物,传统方式主要依靠化学肥料增加土壤养分进而改善根系生长,但是化学肥料会对环境造成危害,根际微生物作为植物的“第二基因组”,能够改善初生根、侧根和根毛的发育,促进植物的生长和根际养分吸收,近年来基因组学−代谢组学、基因组学−转录组学等多组学关联技术的应用揭示了微生物的促生机制,为微生物菌剂的开发提供了新思路。基于该领域的研究现状,本文阐述了根际微生物（AMF、PGPR、根瘤菌）对根构型的调控机制包括激素调控、固氮、溶磷、释放挥发性有机化合物四个方面,并描述它们通过这四种机制增加植物根系长度、根系分支,促进根毛发育的调控效应,基于上述结论,植物根际微生物可以有效改善根系生长,但实际应用效果还有待研究,量化不同机制的相对贡献率以及提高微生物菌剂在实际应用中的稳定性是后续研究的重点。     

微生物代谢尼古丁的研究及其应用

尼古丁是烟叶中最主要的生物碱,也是影响烟叶品质的重要因素,其含量过高不但影响吸食的安全性,而且对环境也会造成危害。有些微生物能在烟叶醇化过程中代谢尼古丁,降低尼古丁的含量,而不影响烟叶原有的品质,并降低其对人类健康的危害。因此,尼古丁降解微生物有着非常好的应用潜力。本文综述了国内外尼古丁代谢微生物的种类、代谢途径、酶学研究、遗传研究以及相关应用研究的进展情况,展示了微生物方法和技术在处理烤烟尼古丁中的应用前景。     

有机磷农药污染土壤的微生物降解研究进展

有机磷农药是目前我国使用量最大的农药之一,严重污染环境和生态系统,并通过食物链在生物体内富集,进而危害人类健康。微生物降解技术具有降解效率高、代谢途径多、无二次污染的优势,是目前清除环境中有机磷农药的主要手段,能有效降低有机磷农药的危害。目前有机磷农药的降解微生物主要是通过实验室纯培养方法获得,与自然生态环境中存在的降解功能性微生物信息差异较大,而利用不可培养方法识别功能性微生物的技术具有广阔的应用前景。本文从有机磷农药的使用情况及引发的环境问题出发,概述了有机磷农药在土壤中的迁移转化途径,稳定同位素探测技术和磁性纳米材料等不可培养方法对有机磷农药降解功能性微生物的识别,微生物降解有机磷农药污染土壤的功能基因、降解途径及降解机理;探讨了植物–微生物联合修复在有机磷农药污染土壤修复中的作用,并分析了环境因子及农药自身性质对有机磷农药降解的影响;最后,讨论了微生物降解技术存在的问题及今后研究方向。     

PLFAs稳定同位素技术及其在土壤微生物学中的应用

磷脂脂肪酸(PLFAs)是微生物细胞膜的重要组分,可作为活体微生物的生物标记物。稳定同位素技术与生物标记物相结合为揭示微生物种群结构及其功能提供了一种有效的方法,可用来阐明复杂土壤生态系统中微生物源有机质代谢途径以及个别微生物种群特征,将特定微生物种群与相应生物化学过程相联系。介绍了PLFAs稳定同位素分析技术,包括气相色谱-燃烧-同位素比例质谱(GC-c-IRMS),气相色谱-质谱联机(GC-MS)以及核磁共振(NMR),并描述上述方法在土壤微生物学中的应用以及其优缺点。     

多环芳烃污染土壤的微生物与植物联合修复研究进展

本文综述了多环芳烃(PAHs)污染土壤中微生物降解途径、机理及生物反应器的应用,并从植物修复角度,进一步阐述了与微生物联合作用促进污染土壤中PAHs降解的途径、机理及其应用。提出了利用微生物共代谢降解及其与植物联合修复PAHs污染土壤环境的生物修复技术未来研究课题。     

森林土壤氧化亚氮排放对氮输入的响应研究进展

大气中氧化亚氮（N2O）浓度的上升加剧了全球变暖。森林土壤在调节大气N2O浓度中发挥着至关重要的作用。近年来,氮（N）输入对森林土壤N2O通量的影响备受关注。然而,森林土壤N2O排放对N输入响应的机制,尤其是植物和微生物对N2O通量的调控作用尚缺乏系统研究。因此,本文综述了N输入如何通过森林植被（根系N吸收、凋落物分解和形成丛枝菌根）和土壤微生物（微生物量和群落组成）调控N2O产生途径从而影响森林土壤N2O排放。结果表明,植物的竞争性氮吸收能降低氮输入对N2O排放的促进作用,其作用大小可能主要取决于土壤“氮饱和”状态。植物凋落物主要通过分解过程中的养分归还和次生代谢产物释放来影响氮输入背景下的森林土壤N2O排放,前者具有促进作用,而后者具有抑制作用。丛枝菌根主要通过吸收有效氮和水分、促进团聚体形成以及改变N2O相关功能基因群落调控森林土壤N2O通量。N输入导致的土壤酸化或养分限制,通常会降低微生物量和/或改变微生物群落组成,从而控制N2O排放。N输入对N2O不同产生途径也会造成影响,受土壤湿度、N2O底物浓度以及N2O相关功能基因丰度（AOB、 AOA、nirK、 nirS和nosZ）的调控。未来在模型预测中,需要将植物氮吸收、凋落物分解、菌根以及N2O产生途径充分纳入模型,以提高模型预测准确性,为全球变化背景下制订森林管理政策和温室气体减排措施提供支持。     

浙贝母HMGR基因保守区序列的克隆及生物信息学分析

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是甲羟戊酸途径中的第一个限速酶,在植物生物碱类物质代谢过程中发挥重要的作用。为探究HMGR酶在浙贝母甾体类生物碱合成代谢途径中的调控作用,以百合科浙贝母狭叶品种为材料,利用RT-PCR技术和Ta克隆技术首次从浙贝母中克隆出HMGR基因保守区序列,长度为390 bp。序列分析表明,浙贝母HMGR基因保守区序列与其他9种植物的HMGR基因有较高的相似性(84%~79%);蛋白质同源比对、特征区及系统进化树分析表明,浙贝母HMGR氨基酸片段与其他植物有较高的同源性(95%~88%),与球药隔重楼和海枣等单子叶植物的亲缘关系较近,据此,初步确定该基因为浙贝母HMGR基因,命名为Ft HMGR。Ft HMGR基因的克隆及分子鉴定为进一步解析该基因在浙贝母甾体类生物碱合成代谢途径中的分子调控作用奠定了基础,有助于对浙贝母活性物质的合成进行调控,从而提高产量。     

茂原链霉菌DSM 40847全基因组测序及序列分析

茂原链霉菌（Streptomyces mobaraensis）是一种高GC含量的革兰氏阳性放线菌,它广泛用于生产转谷氨酰胺酶、博来霉素、莫能霉素等。目前,还没有相关研究报道茂原链霉菌的全基因组序列,这限制了基于功能基因挖掘和利用的定向育种以及分子遗传研究。本研究首次通过高通量测序技术对茂原链霉菌DSM40847进行全基因组测序,使用Velvet软件进行拼接得到266 contigs,整个基因组大小约7.5 Mb,GC含量为73.2%,序列已提交至美国国立生物技术信息中心（NCBI）的GenBank数据库。通过对基因组序列进行分析,成功鉴定转谷氨酰胺酶酶原激活相关蛋白基因,同时对该菌株的次级代谢产物合成基因簇进行了预测,相关研究结果将为茂原链霉菌的功能基因组学研究提供基础数据。     

WRKY转录因子表达谱的研究进展

环境胁迫对植物的生长发育造成重大影响,因此,提高植物的抗逆性是农业面临的重要问题。自然界中存在多种抗逆基因,如抗盐基因、抗旱基因、抗寒基因等。利用植物基因工程和分子生物学技术提高植物对逆境的适应性及其抗逆分子机制的研究已成为当今热点。WRKY转录因子是一类参与多种胁迫反应的诱导型转录因子,本文综述了WRKY转录因子家族的结构特点、WRKY转录因子在非生物胁迫（高温、低温、干旱、盐）、外源物质（激素及O3）处理及生物胁迫下的表达模式。各种胁迫下的表达谱均呈现不同特点,这些差异表达可能与它们所行使的不同生物学功能有关。     

浓核病毒感染早期家蚕血液、中肠蛋白表达差异比较分析

为了探明在浓核病毒镇江株（BmDNV-ZJ）侵染早期,家蚕部分组织蛋白所产生的免疫抵抗性变化机制,本实验采用差异蛋白质组学技术研究分析了BmDNV-ZJ感染早期,家蚕的中肠、血液组织中特异性表达的差异蛋白。实验结果表明：在浓核病毒侵染初期,感受性家蚕的中肠组织受病毒感染而得到特异性表达的蛋白可能为丝氨酸蛋白酶抑制剂和巯基抗氧化酶蛋白,前者具有调控蛋白酶活性和细胞凋亡的功能,后者具有抗氧化的作用。血液组织受病毒感染诱导而产生的蛋白可能是丝裂原活化蛋白激酶和类抗氧化酶蛋白,前者具有调控细胞凋亡的功能,后者具有抗氧化、消除自由基作用。由于试验中所得的差异蛋白点很少,这表明在BmDNV-ZJ感染早期,蚕体对浓核病毒的感染而产生的反应很小。蚕体可通过被侵染的中肠组织（浓核病毒感染的靶部位）P2及血液（免疫组织）共同产生一些抗氧化或调控细胞凋亡的酶蛋白等来抗击浓核病毒的侵染。     

凋亡相关基因PDCD5的表达与桥本甲状腺炎临床相关性的研究

本实验旨在探明程序性死亡因子5（programmed cell death 5,PDCD5）在桥本甲状腺炎（hashimoto＇s thyroiditis,HT）病程中的表达,并研究其与HT疾病发生发展之间的关系。以β-actin基因、β-actin蛋白为内参照,采用RT-PCR法和Western印迹法检测60例HT患者和40例健康对照者外周血单个核细胞（PBMC）PDCD5 mRNA和蛋白的表达水平。以外周血血清中抗甲状腺微粒体抗体（TMAb）水平45%为标准,划分为低TMAb组（TMAb≤45%）和高TMAb组（TMAb〉45%）,比较两组患者的血清TGAb值、甲状腺激素水平及PDCD5的表达水平。结果表明,与健康对照组相比较HT患者PDCD5 mRNA和PDCD5蛋白的表达阳性率和相对表达水平显著升高（p〈0.05）,在高TMAb水平组PDCD5的表达更高,较低TMAb水平组有显著性差异（p〈0.05）,TGAb水平显著高于低TMAb组（p〈0.01）,血清TT3、TT4、FT3、FT4没有统计学差异（p〉0.05）。由于PDCD5的表达量在HT患者PBMC中上调,并且随病情加重其表达量逐渐增加,初步判定在HT疾病的发生发展过程中,PDCD5具有重要意义。     

葡萄基因组中KUP蛋白的生物信息学分析

植物钾（K＋）转运体蛋白在K＋的跨膜运输中起重要作用,进而维持植物体正常生长和代谢活动。本研究中,通过隐马尔科夫模型（HMM）和葡萄蛋白质库搜索,共找到18个葡萄钾转运体蛋白（VvKUPs）。利用生物信息学方法,我们对葡萄家族12条KUP蛋白序列的系统发生和KUP基因组定位进行分析,然后对其氨基酸组成成分、理化性质以及二级结构进行预测和分析,同时还分析了葡萄与拟南芥、水稻和杨树的K卯基因家族之间的联系。基因组定位结果发现其分布在至少9条染色体上。二级结构预测结果发现不同成员间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异;仅一螺旋和无规则卷曲为主要二级结构组成部分。基因结构分析表明,KUP基因家族成员分别含有7～10个内含子。葡萄KUP蛋白的亚细胞定位分析表明VvKUP主要定位于膜结构上。电子表达图谱分析结果表明：12条K卯基因有对应的EST序列,其中的11条KUP有相应的电子表达谱,并主要在花、果实、花序和花蕾等组织部位表达。     

3种大蒜中洋葱黄矮病毒的RT-PCR分子鉴定

洋葱黄矮病毒（Onion yellow dwarf virus,OYDV）是危害大蒜产量和品质的主要病毒之一。快速有效的病毒检测方法可为大蒜病毒病的研究和有效防御提供理论与技术资料。本研究利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对甘肃＂成县迟蒜＂和山东＂鲁蒜王2号＂中OYDV外壳蛋白基因进行特异性扩增,并克隆到载体PMD18-TEasy Vector上进行核苷酸序列测定及分析。成功分离得到OYDV的两个DNA片段——GSCCS和SDLSW2,与GenBank中已报道的AB000837.1、AB000838.1和AJ409311.1等22个OYDV DNA片段的核苷酸相似性分别为81%～98%和81%～84%,氨基酸相似性分别为85%～99%和89%～94%,二者之间核苷酸相似性为84%,氨基酸相似性为89%。系统进化树显示不同DNA片段可聚为3个组群,GSCCS与中国山东金乡OYDV DNA片段同属一组,SDLSW2与其它16个OYDV DNA片段同属一组,表明OYDV在甘肃＂成县迟蒜＂和山东＂鲁蒜王2号＂中均存在,但具有一定差异。本实验确定了OYDV的基因变异程度,为进一步研究病毒进化和变异提供了有利条件。     

户户通平台构建及农业科技信息传播问题思考

科技信息户户通综合服务平台（以下简称户户通平台）是以电话网、互联网、广电网、专家网和组织网五网融合为基础,以电话机（固定电话、移动电话）、计算机、电视机、收音机、农信机为载体,以农村科技服务组织、农业科学数据库和专家团队为支撑的农业科技信息传播系统。它以需求为目标、市场为导向,运用计算机技术、通信网络技术、现代管理技术对涉农政务、实用技术、社科知识、市场信息等科技资源进行系统整合,主要通过电话等应用终端曲线上网,为农业、农村和农民提供高质量的科技传播与咨询服务。     

基质固相分散萃取-气相色谱法同时检测人参中五氯硝基苯及其代谢物残留

采用基质固相分散萃取-气相色谱（MsPD—Gc）技术,建立了人参中五氯硝基苯（PcNB）及其代谢物五氯苯胺（PcA）和甲基五氯苯基硫醚（PcTA）残留的多残留分析方法。将人参样品与弗罗里硅土（m/m,1：2）充分研磨5min后装入10mL玻璃注射器内,通过正己烷：丙酮（V／V,5：5）混合溶液洗脱实现了人参中五氯硝基苯及其代谢物的同时提取和净化。结果表明,应用该方法测定人参中五氯硝基苯、五氯苯胺及甲基五氯苯基硫醚,回收率为89．41％～104．42％,相对标准偏差为3．73％-7．43％,五氯硝基苯及其代谢物的方法检出限均小于2ug·kg^-1。     

Phytoremediation: European and American trends successes, obstacles and needs

Phytoremediation is an emerging technology based on the use of green plants to remove, contain, inactivate or destroy harmful environmental pollutants. Recent developments in Europe and the USA show that the approach is somewhat different on both sides of the Atlantic. In Europe, phytoremediation has more basically been research driven and, based on the outcomes, applications have been envisaged. By contrast, the approach in the USA is more application and experience driven. In spite of a growing track record of commercial success, more demonstration projects are needed to prove that phytoremediation is effective in order to rigorously measure its underlying economics, and to expand its applications. More fundamental research is also required to better understand the complex interactions between pollutants, soil, plant roots and micro-organisms at the rhizosphere level, to increase the bioavailability of pollutants, to fully exploit the metabolic diversity of plants and, thus, to successfully implement this new green technology.