山核桃干腐病发生发展规律及防治技术

山核桃干腐病Macrophoma caryae是山核桃Carya cathayensis林的一种新病害。研究发现,该病每年3月下旬始发,至11月下旬以菌丝体在病组织越冬。为了有效控制该病的蔓延,选择14种药剂对它们开展单稀释倍数抑菌试验,并将抑菌效果好的3种药剂进行8种梯度稀释倍数试验。再按筛选出的最佳防治药剂及其稀释倍数进行实地防治试验,获得最佳防治药荆和方法。结果表明：当4—5月山核桃干腐病的病原菌孢子发生盛期,在病株上喷洒体积分数为80％402抗菌剂乳油1：100～1：2500倍液、80％乙蒜素乳油1：100～1：2500倍液和95％硫酸铜晶体1：100～1：500倍液的可选配比溶液时,均能有效控制山核桃干腐病病原菌孢子的蔓延：而在8—9月该病病原菌入侵山核桃木质部时,在刮除病斑或在病斑上深划线后,再用80％乙蒜素乳油、80％402抗菌剂和95％硫酸铜晶体中的任何一种杀菌剂的1：100～1：500倍溶液进行喷雾防治,15d后均可见明显的防治效果。图1表3参9     

山核桃干腐病病原菌的鉴定

葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌是很多木本植物溃疡病和枯梢病的重要病原菌。已有报道认为:山核桃干腐病病原菌为茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea,但对于葡萄座腔菌科其他真菌与山核桃干腐病的关系还没有深入研究。分离得到了山核桃干腐病相关病原菌,通过比较其形态学特征和核糖体DNA内转录间隔区(rDNA ITS)序列特征,将分离得到的供试菌株分为3组。根据形态学特征和基于ITS序列的系统发育分析,3组菌株分别鉴定为Botryosphaeria dothidea,B.fabicercianum和B.obtusa。其中B.dothidea为优势菌株,分离频率为71.42%,B.fabicercianum和B.obtusa分离频率分别为14.28%。经致病性测定,上述分离菌株均能引起健康山核桃Carya cathayensis枝条发病,但致病性存在差异。在山核桃上发现的B.obtusa和B.fabicercianum为首次报道。     

浙江临安山核桃干腐病发生发展规律

山核桃Carya cathayensis干腐病是影响山核桃树体生长发育、造成果实减产的最主要病害,在浙江省临安市山核桃产区发生普遍。为了控制病害的发展,减少因病害造成的损失,对临安市山核桃主产区的山核桃林进行了广泛的调查与定株观察。研究发现:该病每年3月下旬始发,至11月下旬以菌丝体在病组织越冬。山核桃干腐病的发生与树龄、郁闭度、结实情况、立地条件、经营水平等因子有关。10~30年生的树木发病最严重,树木郁闭度高,立地条件好,经营水平高的地方发病较轻。图1表4参10     

实时荧光定量PCR定量检测山核桃干腐病病菌潜伏侵染量方法的建立

由茶麋子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea引起的山核桃Carya cathayensis干腐病是山核桃栽培过程中的主要病害,该病菌表现明显的潜伏侵染特性。研究山核桃树体中干腐病菌的定量检测技术对山核桃干腐病的预测预报及科学防治具有重要的指导意义。根据茶麋子葡萄座腔菌的EF1基因设计特异性引物,通过普通聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光定量PCR（real-time PCR）扩增发现引物EFRT-F1/R1对山核桃干腐病病菌的特异性及扩增效率较高,可稳定扩增出230 bp的目标条带。应用此特异性引物建立的实时荧光定量PCR干腐病病菌检测方法能够定量检测出山核桃植株样品中的病菌含量,灵敏度要比普通PCR高100倍。图6参8     

观赏海棠干腐病病原菌鉴定

从观赏海棠干腐病病斑处分离纯化病原菌,采用柯赫氏法则对从病原菌进行验证,通过形态学结合ITS序列的系统发育分析鉴定确定病原菌种名,得到观赏海棠干腐病相关病原菌ZWY0501、ZWY0502(登录号:MG554650、MG554651),分离频率分别为55.36%、42.86%。2株孢子均无色,香蕉形或椭圆形,(3.13~5.51)μm×(1.19~1.89)μm。ITS系统发育树中,2株约590bp菌株与已登录的苹果腐烂病病株(Valsamali,登录号为:KP337612)同源性最高,最大相似率达到99%。形态学及ITS序列的系统发育分析鉴定ZWY0501、ZWY0502均为苹果黑皮腐壳菌(Valsamali),其为观赏海棠树皮腐烂病病原。研究结果为该病害的控制奠定了科学基础。     

新疆库尔勒地区3种土壤镰孢菌的形态鉴定和ITS rDNA分析

[目的]镰孢菌是土壤真菌中一类能引起植物和昆虫病害的病原,同时又是可利用的资源.掌握库尔勒地区土壤镰孢菌种类情况,对进一步了解和利用镰孢菌具有深远意义.[方法]运用稀释平板法从土壤中分离到3株镰孢菌,采用形态学及其培养特征进行观察描述,同时利用ITS rDNA序列对其系统发育学进行分析,确定分类地位,并分析比较了基于形态学和ITS rDNA序列分析的两种鉴定手段.[结果]3株菌分别鉴定为芳香镰孢菌(Fusarium redolens)、增殖镰孢菌(Fusarium proliferatum)和木贼镰孢菌(Fusarium equisetic).[结论]与传统方法相比,ITS rDNA方法有着较高的灵敏度.在对镰孢菌的鉴定中,只有将形态学与分子生物学鉴定相结合,才能使镰孢菌的鉴定分类更加完善.     

苜蓿内生菌中高效AHL降解菌的筛选和鉴定

从中国新疆、内蒙古和墨西哥等地分离苜蓿内生菌133株,平板筛选到8株细菌具有N-酰基高丝氨酸内酯(N-Acyl-L-homoserinelactone,AHL)降解活性,其中活性较强的菌株有r-12、r-9和R1.5.对8株AHL降解菌做AHL唯一碳源试验,结果发现菌株S35和N46在液体AHL唯一碳源培养基中生长情况较好,D600 nm分别为0.415和0.386,菌株r-9的生长情况最差,D600 nm为0.015.菌株R1.5还具有耐高温、耐盐碱、能分解无机磷、在无氮培养基上生长等优点.经细菌形态学观察、生理生化试验以及16S rDNA序列分析,初步确定菌株R1.5为1株地衣芽孢杆菌.     

山核桃干腐病拮抗细菌的鉴定及其抑菌效果

在山核桃干腐病病原菌的培养过程中,发现1株具有抑菌活性的生防细菌BS111,通过划线培养、形态学及分子生物学的方法进行了山核桃干腐病病原菌拮抗菌的分离纯化及鉴定,并采用平板对峙培养法研究了拮抗菌对山核桃干腐病病原菌的抑菌活性,分别测定了拮抗菌的生长曲线以及无菌滤液不同培养时间不同浓度的抑菌活性,同时对拮抗菌无菌滤液的抑菌活性稳定性进行了研究,并通过光学显微镜研究了其抑菌机理。鉴定结果表明,BS111为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对峙培养结果显示,该拮抗菌菌体对山核桃干腐病病原菌具有明显的抑制作用,抑菌圈直径为18 mm。对拮抗菌生长曲线以及抑菌活性随时间的变化的测定结果显示,拮抗菌BS111在12~24 h为对数期,24 h后进入稳定期,36 h后进入衰亡期,无菌滤液在前12 h抑菌率几乎为0,在24 h时抑菌率迅速增长至70.65%,在60~72 h,抑菌效果有明显提高,最高抑菌率为83.26%。对不同浓度无菌滤液抑菌活性的测定结果表明,抑菌活性随体积分数的降低而下降,EC50值为4.16%。抑菌活性稳定性研究结果表明,无菌滤液对温度不敏感,随p H的升高抑菌活性上升,经紫外光照射后抑菌活性有部分提高。通过光学显微镜观察,无菌滤液能使菌丝变粗,弯曲,有褶皱,部分原生质体消失,菌丝顶端膨大变粗等。     

Nisin产生菌的筛选及鉴定

从新鲜牛奶样品中用M17G筛选培养基定向筛选出20株目的菌株.应用琼脂扩散法,以黄色微球菌(Micrococcus flavus)NCBI8166为指示菌对其发酵产物进行效价测定,经反复筛选,获得1株稳定的高产菌株KY08,产Nisin效价为813IU·mL-1.用细菌鉴定系统Vitek-32进行生化特征鉴定,并参照了<伯杰氏细菌学鉴定手册>(第八版),将KY08菌株初步鉴定为乳酸链球菌种的一个亚种.     

山核桃FLOWERING LOCUST同源基因的克隆与序列分析

根据不同植物FLOWERING LOCUST（FT）同源基因序列的保守区,设计合成1对长度为18bp的PCR简并引物,以山核桃基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长度为152bp的DNA片段,克隆到pMD19-T载体上。测序及序列分析结果表明,扩增所获得的片段序列为FT基因第四外显子部分序列,不含内含子,推测共编码50个氨基酸;其序列在GenBank中注册号为FJ858260．1,同源性比对结果表明,其氨基酸序列与其他植物FT基因的同源性高达88％～96％。     

山核桃APETALA1同源基因的克隆与序列分析

根据植物花分生组织及花器官形成过程中起重要作用的APETALA1（AP1）基因的高度保守区序列,设计合成一对长度为23bp的聚合酶链式反应（PCR）引物,以山核桃Carya cathayensis因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长为486bp的DNA片段,克隆到pMD18-T载体。测序和序列分析结果表明,获得了山核桃AP1同源基因中的1个片段,该片段序列包含2个内含子,长度分别为86bp和291bp,编码区共编码36个氨基酸。其序列已在Gen荷Bank中注册（注册号为EU155118）,在Gen Bank中进行同源性检索结果表明,其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达69％～88％,推测它们在功能上也是相似的。     

基于形态特征和ITS序列对新疆博乐蘑菇的分类鉴定

的纯菌丝.系统进化树显示BL归为Agaricus bitorquis(双环蘑菇)较为合理.     

云南和广东省流行性出血病病毒血清6型毒株(EHDV-6)的分离与遗传特性

【目的】分离流行于我国南方地区的流行性出血病病毒血清6型毒株(EHDV-6),掌握分离毒株的遗传特征。【方法】对设立于我国云南和广东省的哨兵动物定期采血,进行EHDV感染情况监测与病毒分离培养。通过血清中和试验确定分离EHDV的血清型,采用一步法RT-PCR对分离的EHDV-6毒株基因节段2、3、6(Seg-2、-3、-6)进行扩增与序列分析。【结果】2012—2016年,从云南省和广东省的哨兵动物中分离出25株EHDV毒株,其中,11株为EHDV-6型。中国EHDV-6型毒株的Seg-2、-3与-6均属Eastern型,核酸序列相似性分别为99.1%、98.9%和98.8%,在系统发生树上分别聚为1个独立的中国支系。在日本引起疫病暴发的EHDV-6型毒株与中国EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系。日本EHDV-6型毒株在系统发生树上处于中国支系内部,Seg-2、Seg-3与中国毒株的核酸序列相似性分别为98.5%和93.9%。【结论】云南和广东省流行的EHDV-6型毒株核酸与氨基酸序列高度相似;日本和中国的EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系,提示中日之间可能存在EHDV的流动。研究结果为进一步开展我国EHDV-6型毒株流行病学分析、致病性、病原学诊断与疫苗制备等研究提供了基础。     

传染性法氏囊病病毒超强毒地方株HN01的分离鉴定及分子系统进化分析

用分离的疑为鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)超强毒(vvIBDV)地方分离株HN01,经处理后接种SPF鸡,36h后接种鸡开始发病,发病率为100%,死亡率为70%以上。剖检可见与野外病例相同的病理变化,如肌肉、腺胃、心脏出血,法氏囊水肿且多呈"紫葡萄"样外观。经血清学试验、毒力试验、鸡胚接种试验、分子生物学和电镜形态学观察均证明该分离物为超强毒株,从而证明河南省鸡群中存在不同于IBDV一般强毒株、经典株和变异株的超强毒株。通过对IBDV不同毒株VP2基因高变区氨基酸序列的聚类分析发现,HN01与华南超强毒株G9201、欧洲超强毒株UK661关系最接近,而与HK46,OKYM,D6948,UPM92-04和KS等毒株关系依次渐远。