耐辐射异常球菌磷酸戊糖途径对DNA损伤修复的影响

耐辐射异常球菌(D.radiodurans)超强的辐照抗性归因于其高效的DNA损伤修复系统,磷酸戊糖途径(PPP)作为细胞各种糖类代谢枢纽,是合成核苷酸和核酸所需的核糖以及生成细胞还原力(NADPH)的重要途径。为探究D.radiodurans R1中PPP对DNA损伤修复的影响,本研究敲除PPP中编码限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的基因zwf,比较UV辐照后突变株Δzwf与野生型D.radiodurans的生理生化差异。结果表明,zwf突变导致菌株对UV辐照敏感;UV辐照后Δzwf胞内NADPH、D-核糖、核苷酸合成前体IMP、UMP含量明显降低;葡萄糖酸-δ-内酯及D-核糖能完全和部分恢复Δzwf的UV辐射抗性。综上可知PPP通过提供DNA损伤修复原料及还原力,在DNA损伤修复过程中起着重要作用。本研究结果为DNA损伤修复机理提供参考。     

耐辐射球菌中priA类似基因突变对DNA修复和DNA转化的影响

DNA损伤很易阻断复制叉的前进。损伤DNA的修复以及接下来停止复制叉的重启动过程对细胞生存极为重要。依赖于PriA的复制重启动机制是细菌复制重启动的主要途径。为了解priA类似基因Dr2606在耐辐射球菌中的作用,并检测Dr2606在DNA修复中的作用,本研究用卡那霉素抗性基因代替Dr2606阅读框,构建了Dr2606缺失突变株,并对突变株进行UV和丝裂霉素处理,测定了Dr2606突变株的转化效率。Dr2606的突变导致菌体生长缓慢,细胞生存率急剧下降。意外的是,耐辐射球菌的DNA修复能力没有削弱。但突变株的转化效率大大削弱。这说明在耐辐射球菌中priA类似基因Dr2606对停止复制叉的重启动过程并不是必需的;耐辐射球菌不依赖于原点的复制重启动过程可能与其他细菌不同。     

高温诱导体外培养奶牛乳腺上皮细胞的应激响应

实验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究不同时间高温(42℃)热处理对细胞热休克蛋白HSP、细胞凋亡、乳脂肪和乳蛋白合成相关基因mRNA表达丰度的影响.结果发现,热休克转录子hsf-1和热休克蛋白基因hsp27、hsp70和hsp90在高温处理0.5 h后mRNA表达上调,其中hsp70转录水平有急剧上调过程,且随热处理时间延长均表现出先上升后下降的趋势;标志细胞凋亡的Bax基因从处理的0.5 h开始mRNA表达下调,随后升高;但细胞凋亡Bcl-2 mRNA表达上调;在检测的热处理过程中,αS1-酪蛋白(CSN1S1)基因转录先上调后下降,而β-酪蛋(CSN2)和嗜乳脂蛋白(BTN)基因转录均下调;与脂肪酸合成和调控相关的基因乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)、过氧化物酶激活受体.-γ(PPARG)和固醇调节元件转录因子-1(SREBF-1)基因表达显著上调,而过氧化物酶激活受体-α(PPARA)基因mRNA转录没有明显变化.本实验结果证明热应激诱导了奶牛乳腺上皮细胞的应激反应,对细胞的乳蛋白和乳脂肪合成功能产生了显著影响,细胞产生热耐受.     

北极狐PMEL基因启动子活性及转录调控区域研究

前黑素小体蛋白基因(premelanosome protein gene,PMEL)可以直接启动黑素小体内纤维的形成,促进黑素小体合成,是调控动物毛色的主要候选基因之一。目前关于北极狐(Vulpes lagopus)毛色差异表达基因的相关研究相对较少,本研究旨在筛选调控北极狐毛色的PMEL基因的启动子核心区域及转录因子。研究通过基因组测序技术,获得了北极狐PMEL基因启动子序列,利用生物信息学方法对其核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,扩增出该基因不同长度的启动子缺失片段,并连接至p GL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了8个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐PMEL基因的-1 162/+8区域为核心启动子区域;生物信息学预测分析发现在北极狐PMEL基因的-1 162/-655区域存在5个转录因子结合位点,分别为Sp1(-966/-952)、Sp1(-912/-900)、Sp1(-750/-736)、NF-1(-712/-699)和NF-1(-682/-673);利用重叠延伸PCR技术成功构建了5个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现该5个突变载体活性均显著下降(P0.05),表明这5个转录因子是北极狐PMEL基因转录调控的正调控元件。本研究为探究该基因的表达调控机制提供了科学依据,并为北极狐毛皮品质分子育种和彩色毛皮材料的创制提供了思路。     

家蚕杆状病毒bro-d基因缺失对病毒基因转录和细胞凋亡的影响

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)bro (baculovirus repeated ORF)-d基因普遍存在于多种感染鳞翅目昆虫的多角体病毒基因组中,是杆状病毒中一类重复开放阅读框序列.为了解bro-d基因在病毒感染过程中的作用及其与宿主细胞凋亡之间的关系,本研究利用Red重组技术敲除BmNPV基因组中的bro-d基因,构建基因缺失型病毒bro-d-ko-Bacmid,并将该缺失型病毒转染家蚕BmN细胞,利用qRT-PCR技术检测bro-d基因的缺失对病毒基因组复制、转录水平以及抑制凋亡蛋白2基因(inhibitor of apoptosis protein 2,iap2)的影响.结果显示,bro-d基因缺失后会导致病毒基因组的复制水平显著下降(P＜0.05),同时病毒的早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p1O的转录水平也都显著下降(P＜0.05);iap2的转录水平显著下调(P＜0.05).在bro-d基因缺失型病毒的复制水平明显低于野生型病毒的情况下,仍会导致细胞活力显著下降(P＜0.05);bro-d基因缺失引起细胞B淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)蛋白含量明显低于野生型病毒,而Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein,Bax)含量显著高于野生型病毒(P＜0.05),进而导致细胞凋亡水平上升.结果表明,bro-d基因不仅对病毒各时期基因表达水平具有调控作用,也可通过调控iap2的表达进而调控宿主细胞的凋亡水平.研究成果为深入了解bro-d基因在病毒感染过程中的功能提供了基础资料,也为通过延长宿主细胞寿命、提高目的蛋白表达产量来进行杆状病毒表达载体的改造提供了新思路.     

UV-B诱导拟南芥查耳酮合成酶（CHS）基因表达及其信号传导途径

应用RT-PCR技术研究了6个拟南芥（Arabidopsis thaliana）株系的查耳酮合成酶（CHS）基因转录对UV-B照射以及过氧化氢（H2O2）、D/L-NG -一甲基精氨酸（D-NAME、L-NAME）和2-苯基-l-4,4,4,4-四甲基咪唑啉-1-烃氧基-3-氧化物（PTIO）等化合物处理的响应。结果表明，在6个株系中，Fah1-2突变株UV-B伤害最为敏感，而野生型WS2对UV-B伤害耐受力最强；在15 μmol/m2/s UV-B照射2 h，CHS基因转录产物明显增加，但24 h后消失。H2O2对CHS基因转录没有显著作用，D-NAME 和L-NAME能抑制CHS在UV-B照射下表达转录的增加，而PTIO对CHS基因表达的抑制作用很弱。据此认为，CHS基因对UV-B照射响应的表达和转录不受NO和H2O2的调节     

质子对小麦的诱变效应及作用机理研究 Ⅱ质子处理对小麦种胚DNA损伤修复的影响

用3H TdR标记小麦种胚 ,研究了质子处理的种胚萌发早期DNA合成动态 ,并与γ射线辐照进行对比。表明质子处理能引起肿胚DNA损伤修复合成 ,即DNA非按期合成 ,京 41 1与原冬 977的修复复制峰期分别出现在正常的DNA合成峰期前 4h与 2h。以京 41 1为例 ,比较质子处理与γ射线辐照的种胚DNA损伤修复特点的差异 ,质子的DNA非按期合成峰期出现时间早于γ射线处理的 2h ,正常的DNA合成峰期晚于γ射线处理的 4h ,且在DNA非按期合成峰期后的DNA合成量明显低于γ射线。     

程序性翻译后修饰对FEN1功能调控的研究进展

瓣状核酸内切酶(FEN1)是结构特异性5'核酸酶超家族成员,以参与冈崎片段成熟、DNA重组、细胞凋亡DNA片段化和长片段碱基切除修复(LP-BER)而闻名,在生物体的多种代谢途径中发挥作用,对维持不同物种基因组的稳定性发挥着十分重要的作用。FEN1的功能或表达异常会导致生物体内的多个生命过程发生紊乱,如突变率增加、微卫星序列不稳定、DNA降解等,对生物体造成严重危害。因此,FEN1在生物体内的表达必须受到严格、精确、及时的调控。研究表明,翻译后修饰对FEN1蛋白的活性强弱、细胞定位及功能稳定性发挥着重要的调控作用。本文对关于FEN1翻译后修饰调控的相关研究进展进行总结,系统归纳翻译后修饰对FEN1功能的调控和影响,为后续开展FEN1程序性调控研究提供了参考。     

玉米转录因子ZmBES1/BZR1-7基因克隆及功能分析

BES1/BZR1蛋白是油菜素内酯信号途径的唯一转录因子,在植物生长发育及逆境应答中发挥重要作用。为了探究玉米ZmBES1/BZR1-7基因的功能,从玉米自交系B73中克隆到ZmBES1/BZR1-7基因,并对其功能进行初步分析。序列分析结果表明,ZmBES1/BZR1-7基因无内含子,开放阅读框(ORF)长975 bp,编码324个氨基酸。ZmBES1/BZR1-7蛋白N端高度保守,包含bHLH结构域,与水稻OsBZR1-1相似性达75.95%。实时荧光定量PCR结果表明,ZmBES1/BZR1-7在玉米叶和根中的表达受渗透与盐胁迫诱导显著;16% PEG-6000和100 mmol·L^-1 NaCl处理12 h,叶片中ZmBES1/BZR1-7表达量分别为对照的17.8倍和19.8倍。酵母激活试验结果表明,ZmBES1/BZR1-7蛋白具有转录激活活性。共相关分析结果表明,玉米中有72个基因与ZmBES1/BZR1-7基因的表达相关性较高,启动子区均含有E-box或BRRE元件,推测可能是ZmBES1/BZR1-7转录因子调控的靶基因,主要参与细胞、细胞组分、细胞代谢过程等。本研究结果为深入解析玉米ZmBES1/BZR1-7的功能及其调控网络奠定了基础。     

翻译调节肿瘤蛋白(TCTP)与细胞生长调控

翻译调节肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)是一个在物种间高度保守、广谱表达和多功能的蛋白质,具有调节细胞骨架的动态变化和调节细胞的生长与增殖的作用；能够激活干细胞标记基因Oct4和Nanog的转录；调节细胞凋亡、肿瘤逆转、细胞分化、炎症反应和保护细胞免受多种应激的损伤等.本文综述了TCTP的结构、表达调控、生物学功能等研究进展.     

nm23-H1对全反式维甲酸诱导的人肝癌细胞凋亡及其相关信号转导通路的影响

为了解nm23-H1转染对全反式维甲酸诱导的人肝癌H7721细胞凋亡的影响,本研究通过质粒转染把nm23-H1导入人肝癌7721细胞,建立了nm23-H1过表达稳转细胞株。首先采用MTT法测定细胞生长曲线,再通过流式细胞术和丫啶橙染色法观察细胞凋亡,最后采用Western blot检测凋亡相关的信号通路分子bcl-2、PKB、PKB-Ser473、PKB-Thr308和p53的表达情况。研究发现,nm23-H1转染对人肝癌7721细胞的生长没有影响;但nm23-H1转染能明显促进全反式维甲酸诱导的细胞凋亡,nm23-H1转染细胞凋亡率为18.2%,而对照细胞凋亡率仅为1.0%;nm23-H1和对照细胞的过量表达对bcl-2的表达没有明显影响,但PKB的Ser473和Thr308位的磷酸化显著下调,抑癌基因p53的表达量上调。研究结果表明,nm23-H1的过量表达增加了人肝癌细胞对全反式维甲酸诱导的凋亡的敏感性,因此推测nm23-H1可作为肝癌治疗的有效靶点。     

α1，3-岩藻糖基转移酶Ⅶ转染对全反式维甲酸诱导的人肝癌细胞凋亡的影响

为了解α1,3-岩藻糖基转移酶Ⅶ（α1,3FucT-Ⅶ）转染对全反式维甲酸诱导的人肝癌7721细胞凋亡的影响及其分子机理,本研究通过质粒转染把α1,3FucT-Ⅶ导入人肝癌7721细胞,建立了稳定表达不同量α1,3FucT—Ⅶ的H7721细胞株。采用流式细胞术测定细胞表面SLex的表达及细胞凋亡、Western blot方法检测Caspase-3、免疫荧光染色法观测细胞骨架蛋白——肌动蛋白F—actin的变化、caspase-3抑制剂DEVD—CHO抑制caspase-3的活化。研究结果表明,用全反式维甲酸诱导细胞凋亡,α1,3FucT—Ⅶ的过量表达使凋亡细胞数量明显增多,caspase-3的活性和细胞骨架F-actin的破坏均增高,抑制剂DEVD—CHO可明显抑制细胞凋亡,但F—actin的破坏程度并未得到改善。通过caspase -3通路转染α1,3FucT—Ⅶ增加了肝癌细胞对全反式维甲酸诱导的凋亡的敏感性,从而为肝癌的防治提供了实验依据。     

凋亡相关基因PDCD5的表达与桥本甲状腺炎临床相关性的研究

本实验旨在探明程序性死亡因子5（programmed cell death 5,PDCD5）在桥本甲状腺炎（hashimoto＇s thyroiditis,HT）病程中的表达,并研究其与HT疾病发生发展之间的关系。以β-actin基因、β-actin蛋白为内参照,采用RT-PCR法和Western印迹法检测60例HT患者和40例健康对照者外周血单个核细胞（PBMC）PDCD5 mRNA和蛋白的表达水平。以外周血血清中抗甲状腺微粒体抗体（TMAb）水平45%为标准,划分为低TMAb组（TMAb≤45%）和高TMAb组（TMAb〉45%）,比较两组患者的血清TGAb值、甲状腺激素水平及PDCD5的表达水平。结果表明,与健康对照组相比较HT患者PDCD5 mRNA和PDCD5蛋白的表达阳性率和相对表达水平显著升高（p〈0.05）,在高TMAb水平组PDCD5的表达更高,较低TMAb水平组有显著性差异（p〈0.05）,TGAb水平显著高于低TMAb组（p〈0.01）,血清TT3、TT4、FT3、FT4没有统计学差异（p〉0.05）。由于PDCD5的表达量在HT患者PBMC中上调,并且随病情加重其表达量逐渐增加,初步判定在HT疾病的发生发展过程中,PDCD5具有重要意义。     

枯萎病菌侵染后香蕉乙烯形成酶基因MaA CO及乙烯响应因子MaERF1表达水平分析

香蕉与枯萎病互作机理研究一直是近年来研究的热点,目前对枯萎病菌的致病机理及香蕉的感、抗病机理还不清楚。本文利用前期表达谱分析结果克隆了乙烯合成及调控途径中的关键酶基因乙烯形成酶基因（MaACO）和乙烯响应因子基因（MaERF1）,通过RT-PCR检测,对这两个基因在感、抗病香蕉种质中的表达水平进行研究。结果表明,MaACO和MaERF1基因对机械损伤非常敏感,尤其在损伤初期（3h）的表达水平远高于后期;对于枯萎病菌侵染处理的植株,尤其在感染初期（3h）MaACO和MaERF1的表达水平在抗性植株中的表达量均比感病植株中的低;抗性种质中乙烯途径可能受到抑制,香蕉的感病性可能与侵染初期对乙烯信号的敏感性相关。本研究为利用乙烯抑制剂进行香蕉抗枯萎病新方法的研究奠定了基础。     

莫能菌素对蚯蚓（Eisenia fetida）活体DNA的损伤研究

通过单细胞凝胶电泳实验研究了不同浓度莫能菌素暴露对赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）体腔细胞DNA的损伤,结果显示,50mg.kg-1莫能菌素处理组尾部DNA含量值最大、尾长值最大、Olive尾矩值最大,分别为34.539%、107.736μm和29.354;随着莫能菌素暴露剂量的增加,尾部DNA含量、Olive尾矩和尾长损伤频率增加;尾部DNA含量对莫能菌素暴露最为敏感,对照组和各处理组的尾部DNA含量之间均存在显著性差异（P〈0.05）;对照组与15、25、50 mg.kg-1处理组的Olive尾矩和尾长损伤频率之间均存在显著性差异（P〈0.05）;暴露浓度与尾部DNA含量、Olive尾矩和尾长具有良好的剂量-效应关系（P〈0.05）。实验结果表明,蚯蚓体腔细胞DNA损伤可作为指示莫能菌素影响的生物标志物,彗星试验是检测莫能菌素暴露对赤子爱胜蚓活体基因损伤的有效手段。     

鸭脂联素基因多态对肉质和血清生化指标的影响

脂联素在调控动物脂质代谢过程中起着重要作用。根据鸭脂联素基因序列设计1对特异引物扩增兴义鸭和三穗鸭脂联素基因内含子1和部分外显子2,采用SSCP法和DNA直接测序技术检测其多态,分析多态对鸭肉质和血清生化指标的影响。结果显示,在2个鸭群体中均检测到3种基因型BB、BC和CC,等位基因B和C,B均为优势等位基因,多态信息含量均表现为中度多态,卡方检验显示基因型分布均处于Hardy-Weinberg平衡状态（p〉0.05）;不同基因型序列比对发现2个SNPs：内含子1的295C〉T突变和外显子2的456T〉C沉默突变;最小二乘分析显示,BB基因型个体的肌内脂肪、血清白蛋白、血清甘油三酯和血清总胆固醇显著高于CC基因型个体（p〈0.05）,表明该多态座位可能对鸭脂肪沉积有一定影响。     

Antcin B and its ester derivative from Antrodia camphorata induce apoptosis in hepatocellular carcinoma cells involves enhancing oxidative stress coincident with activation of intrinsic and extrinsic apoptotic pathway

The triterpenoids methylantcinate B (MAB) and antcin B (AB), isolated from the medicinal mushroom Antrodia camphorata , have been identified as strong cytotoxic agents against various type of cancer cells; however, the mechanisms of MAB- and AB-induced cytotoxicity have not been adequately explored. This study investigated the roles of caspase cascades, reactive oxygen species (ROS), DNA damage, mitochondrial disruption, and Bax and Bcl-2 proteins in MAB- and AB-induced apoptosis of hepatocellular carcinoma (HCC) HepG2 cells. Here, we showed that MAB and AB induced apoptosis in HepG2 cells, as characterized by increased DNA fragmentation, cleavage of PARP, sub-G1 population, chromatin condensation, loss of mitochondrial membrane potential, and release of cytochrome c. Increasing the levels of caspase-2, -3, -8, and -9 activities was involved in MAB- and AB-induced apoptosis, and they could be attenuated by inhibitors of specific caspases, indicating that MAB and AB triggered the caspase-dependent apoptotic pathway. Additionally, the enhanced apoptotic effect correlates with high expression of Fas, Fas ligand, as well as Bax and decreased protein levels of Bcl-(XL) and Bcl-2, suggesting that both the extrinsic and intrinsic apoptosis pathways were involved in the apoptotic processes. Incubation of HepG2 cells with antioxidant enzymes superoxide dismutase and catalase and antioxidants N-acetylcysteine and ascorbic acid attenuated the ROS generation and apoptosis induced by MAB and AB, which indicate that ROS plays a pivotal role in cell death. NADPH oxidase activation was observed in MAB- and AB-stimulated HepG2 cells; however, inhibition of such activation by diphenylamine significantly blocked MAB- and AB-induced ROS production and increased cell viability. Taken together, our results provide the first evidence that triterpenoids MAB and AB induced a NADPH oxidase-provoked oxidative stress and extrinsic and intrinsic apoptosis as a critical mechanism of cause cell death in HCC cells.     

大肠杆菌转录后调控蛋白CsrA的C末端具有抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性的功能

CsrA（在有些细菌例如十字花科黑腐病菌中也称为RsmA,统称CsrA／RsmA）是一类在细菌中广泛分布而且氨基酸序列非常保守的RNA结合蛋白。研究表明,CsrA／RsmA作为转录后全局调控因子参与了包括细胞碳代谢、次生代谢、运动性、生物被膜形成以及动植物病原菌的致病过程等许多细胞过程的调控。CsrA／RsmA在不同的细菌中的生物学功能各有异同。在大肠杆菌中,CsrA的主要功能是控制细胞的碳代谢、运动性和生物被膜形成;而在十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestrispathovarcampe5tris,Xcc）中,CsrA的同源蛋白RsmA的主要功能除了控制碳代谢、运动性和生物被膜形成外,还控制致病性和胞外酶的产生。大肠杆菌的CsrA（CsrAEcoli）是否具有XccRsmA（RsmAXcc）的功能？为了回答这个问题,我们用大肠杆菌的csrA基因（csrAE.coli）互补Xcc的耶剃基因（rsmAXcc）的缺失突变体DM2506。结果显示,csrAE.coli能够互补DM2506的所有表型,说明csrA。瑚具有RsmAXcc的全部功能。更重要的是,我们发现,无论是瑚,叫枷突变体还是野生型菌株,导入表达CsrAE.coli扰的质粒后均导致其致胞外蛋白酶活性的严重下降,证明CsrAE.coli,以具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的作用。进一步的实验证实,CsrA E.coli的C末端第53～61位氨基酸残基具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的功能。     

洛克沙胂对鲫鱼两种生态毒理学指标的影响

采用静态试验法,将鲫鱼暴露于4、16、64mg·L^-1洛克沙胂中48、96、144h后,检测了鱼鳃、肾脏和肝的Na^＋-K^＋-ATP酶活性。结果表明,在同一组织中,随着处理浓度的提高,洛克沙胂对鲫鱼各组织Na^＋-K^＋-ATP酶活性抑制作用增强。对于不同组织,同一处理浓度的洛克沙胂对鲫鱼鳃中Na^＋-K^＋-ATP酶活性抑制作用更为明显,其次是肝和肾（P〈0．01）。在同一浓度下,洛克沙胂对鲫鱼各组织Na^＋-K^＋-ATP酶活性抑制率呈明显的时间-效应关系,暴露时间越长,抑制率越高（P〈0．01）。此外,单细胞凝胶电泳试验（SCGE）结果表明,鲫鱼暴露于0．5、1、2mg·L^-1洛克沙胂中72h能引起鲫鱼肾细胞明显的DNA损伤,并在设定剂量范围内呈现一定的剂量-效应关系;同时,鲫鱼肾细胞于体外暴露于1、10、100、500、1000mg·L^-1洛克沙胂3、6、12h后,可引起严重的DNA损伤。