多重PCR检测多价转基因甘蔗

甘蔗(Saccharum officinarum)是制造蔗糖、提炼乙醇的主要原料。随着甘蔗转基因育种的开展,建立一套快速精准转基因分子检测技术在甘蔗转基因研究中有重要的应用前景。本研究以二价抗虫转基因甘蔗为材料,利用多重PCR建立同时检测Bar基因、Bt基因和马铃薯蛋白酶抑制剂基因(PinⅡ基因)。研究表明,该多重PCR检测体系的最佳退火温度为53℃,有效扩增Bar基因(415 bp)、Bt基因(780 bp)和PinⅡ(1 000 bp)3个基因片段。多重PCR技术进行外源基因的检测,节省时间、降低成本、提高效率并可以对该转化植物进行特异性鉴定。     

纳米磁珠联合PCR检测甘蔗杆状病毒方法的建立和初步应用

本研究通过对DNA提取裂解液的成分和用量以及裂解时间等因素进行系统优化,建立了一种高通量的磁珠法提取甘蔗总DNA,再进行PCR检测甘蔗杆状病毒(SCBV)的方法。采用核酸自动提取仪,应用纳米磁珠提取甘蔗总DNA,经PCR检测甘蔗杆状病毒,并与以试剂盒提取DNA为模板的PCR检测结果进行比较。结果显示,经优化的裂解液成分为EDTA·Na20.08 mol/L、NaCl 0.8 mol/L、SDS 2%和Tris-HCl0.10 mol/L,裂解时间为20 min,可用于纳米磁珠提取甘蔗总DNA进行SCBV检测。所建立的方法通量高、成本低、耗时短,可用于SCBV的批量检测。     

转ScMV-CP基因甘蔗的分子生物学分析与鉴定

采用改良的CTAB方法提取转基因甘蔗幼苗的基因组DNA,核酸蛋白测定仪分析及凝胶电泳结果表明,提取的DNA具有典型的DNA分子的标准紫外吸收光谱特点,DNA产量为45～60μg／100mg。同时根据质粒载体设计合成了2对引物,分别扩增新霉素磷酸转移酶(nptⅡ)基因和甘蔗花叶病毒外壳蛋白(ScMV-CP)基因。PCR检测结果表明,在53株待检测的样品中有24株同时含有这2种转基因成分,其中13株在Southern杂交中有杂交信号出现,其拷贝数为1～3个。     

三种不同核酸分析系统的效率比较分析

以4种转基因玉米基因组DNA为研究对象,使用转基因事件特异性引物进行普通PCR及多重PCR扩增,并分别应用普通琼脂糖电泳以及ABI 3730XL、岛津MultiNA、QIAGEN QIAxcel这3种核酸分析仪进行分析,比较了各种检测方法的优缺点。研究结果对不同检测需求的核酸片段大小分析方法提供了重要参考。     

黑龙江省大豆产区疑似转基因大豆的分子检测

利用表型鉴定和PCR分子检测相结合的方法,对黑龙江省国储库拒收的疑似转基因大豆进行了转基因成分检测.表型鉴定方法为草甘膦叶片涂抹,PCR分子检测对象为CaMV35S启动子、NOS终止子及目的基因CP4-EPSPS.利用大豆自身的凝集素基因作为PCR检测的内标基因,以有效排除DNA质量、实验操作等因素对检测结果的影响.结果表明,所测材料不抗草甘膦除草剂,也不合所检测的外源基因,由此判断该批次材料不是转基因大豆.     

烟草(Nicotiana tabacum)生长素响应基因NtIAA27的克隆及功能分析

为了研究内源生长素信号路径对烟草烟碱合成的调控,本研究根据烟草基因组数据和PCR扩增获得烟草生长素响应蛋白NtIAA27基因RNAi干扰片段180 bp,将该基因180 bp的片段克隆至RNAi载体pHellsgate12中,并通过叶盘法将该基因转入烟草K326中。经过实时定量PCR检测获得两株敲除效率较高的转基因植株,对这两株转基因株系及非转基因材料进行烟碱含量测定,结果表明与非转基因植株相比,RNAi转基因植株的烟碱含量升高,表明内源生长素信号路径可以负调控烟草烟碱含量,本研究将为培育不同烟碱含量的烟草品种提供有价值的信息。     

三种DNA提取方法对检测草莓镶脉病毒稳定性的研究

草莓成熟叶片中含有大量的多糖、蛋白质、多酚和色素等物质,影响高质量DNA的提取和下游PCR反应的进行。为确定适用于PCR技术检测草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)的DNA提取方法,从草莓叶片中提取DNA后,对样品中的SVBV进行特异性的PCR检测,比较确定不同DNA提取方法对PCR检测SVBV稳定性的影响。以感染SVBV的草莓叶片为材料,分别采用CTAB试剂盒法、高盐低pH法、改良SDS法提取草莓叶片的总DNA,将不同方法提取的DNA通过紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法进行测定,对DNA产量和质量进行分析。结果表明,3种方法均能获得较为完整的DNA片段,用CTAB试剂盒提取的DNA质量最高,改良SDS法提取的DNA质量较低。将不同方法提取的DNA经过PCR反应特异性检测SVBV后,将与目的片段大小一致的PCR扩增产物经序列测定及分析,证明与SVBV的序列相吻合,证明了方法的可靠性,其质量能够满足PCR特异性检测需要。     

一种简单高效提取高质量转基因拟南芥和烟草DNA的方法

本研究以转基因拟南芥和烟草叶片为材料,通过对DNA提取操作步骤及试剂用量进行了优化,探索出了一种简单高效的转基因拟南芥和烟草DNA提取方法。实验结果表明,本方法提取的拟南芥和烟草DNA条带清晰,完整,无降解,浓度较高,只有少量的蛋白质残留。利用PCR技术对提取的DNA样品进行检测,结果显示,所有的样品均能够扩增出目标条带,并且条带清晰。相比传统的拟南芥和烟草DNA提取方法,本方法具有简单,成本低,效率高,毒性低,时间短,提取DNA浓度高、纯度高等优点,适合于大批量转基因DNA的提取和鉴定。     

黄瓜叶片直接PCR扩增方法的建立

为了快速对黄瓜样品进行基于PCR的分子鉴定,本研究以我国华北型黄瓜品种"长春密刺"的幼嫩叶片为材料,通过筛选DNA聚合酶的种类、改变黄瓜叶片取样量以及扩增产物长度等条件,对叶片直接PCR的体系进行了建立和验证。结果表明,普通Taq酶和Hiproof高保真酶对叶片直接PCR扩增的效果较好,与对照CTAB法提取的DNA相比,20μL、200μL和1 000μL枪头的叶片取样量、不同GC含量(25%~65%)和不同扩增长度的DNA模板对PCR扩增效果无明显差异;此体系也可用于黄瓜的茎、花、果实等组织部位上。该试验方法的建立及应用,省去了DNA体外提取过程,有助于提高基于黄瓜PCR基础上的分子检测效率。     

转耐盐基因水稻的PCR检测方法及其分子辅助育种

研究采用改良CTAB法和磁珠自动提取法提取水稻种子基因组DNA,通过对水稻内源SPS基因、ThST3和Ubiquit-in启动子间构建特异序列进行PCR扩增,扩增产物结合排枪凝胶电泳实现快速检测。其中PCR扩增内源SPS基因的结果表明,采用改良CTAB法和磁珠自动提取法可用于市售水稻种子和转基因种子的DNA提取。实验合成的构建特异引物以及建立的PCR扩增反应体系能特异性地检测转耐盐基因水稻Theli。该方法检测灵敏度高,绝对检测低限达17.3×10-2ng,相对检测低限为0.41%,能有效地对转基因水稻ThST 3进行鉴定;稳定性好,可完全满足转基因水稻的定性检测、监督和标识管理需要。同时可用于对转基因水稻的辅助选择(MAS)育种。     

甘薯基因组DNA高效快速提取方法

甘薯基因组DNA传统的CTAB提取法,提取DNA质量好,但提取效率不高.为满足甘薯分子标记辅助育种、核心种质和遗传连锁图谱构建以及转基因植株检测的需要,通过对传统的CTAB法进行改进,本研究建立了一种高效快速价廉的甘薯及其近缘野生种基因组DNA提取方法,适合于PCR扩增以及AFLP分析.本方法使用1.5 mL离心管和专用棒槌,整个过程转管1次,提取的DNA主带明显,片段大小一致,得率达5 μg/mg叶片冻干粉.提取质量可靠,RAPD-PCR和酶切后AFLP扩增,与传统CTAB法提取DNA扩增结果没有明显差异.与传统的CTAB方法相比,该方法快速(提取过程不足30 min),效率高,从10 mg叶片冻干粉中一次可提取50 μg左右的DNA模板,操作简便,污染降低,实用性强.     

应用降落PCR和正交设计优化甘蔗“割手密”SSR-PCR反应体系

甘蔗野生种割手密抗逆性强,在甘蔗抗逆育种中具有较好的应用前景;割手密SSR分子标记技术体系的建立及优化可为割手密指纹图谱绘制、种质鉴定、遗传多样性及亲缘关系分析提供技术支持。本研究以21份割手密材料用改良CTAB法提取DNA,采用降落PCR和正交试验设计对扩增反应体系主要成分的浓度(DNA模板,引物,Mg2+,d NTPs,Taq聚合酶)进行了优化。结果表明建立的割手密Touchdown SSR-PCR分子标记技术体系操作简便,扩增条带清晰且多态性丰富,有较强的稳定性和可重复性,可为割手密资源的相关研究提供技术支持。     

DNA指纹用于杂交水稻种子纯度和真伪鉴定的研究进展

本文简要阐述了RAPD、RFLP、AFLP、SSR等几种主要的建立DNA指纹图谱的分子标记技术及其在杂交水稻种子纯度和真伪鉴定中的研究和应用情况,同时评述了这几种分子标记技术各自的优缺点,并就水稻DNA提取方法的改进、PCR扩增反应程序和反应体系的优化、扩增产物的检测以及DNA指纹在杂交稻种子纯度和真伪鉴定中的准确性等问题进行了讨论。DNA指纹在杂交水稻种子纯度和真伪鉴定中具有广阔的应用前景,关键是要建立一套完善的、标准化的技术体系,进一步简化实验操作程序,降低成本,真正做到简单快速、准确可靠,使DNA指纹能用于规模化、商业化的种子质量鉴定之中。     

棉纤维DNA的提取及其在品种溯源中的尝试

【目的】针对我国进口棉花原料以及收储棉花的品种产地溯源监控技术体系缺乏的问题,探索了适用于棉纤维DNA的提取方法,旨在建立以棉纤维DNA为介质鉴定棉花品种真实性及产地溯源的体系。【方法】通过改进和优化提取方法,提取了开花后不同时间棉纤维及不同年份皮棉的DNA,以其作为模板,进行了常规聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增;并选取13对简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)引物对鲁1127、石抗126和瑞杂816棉纤维DNA进行SSR-PCR扩增。【结果】此DNA提取法可提取出不同发育时期和不同年份的棉纤维DNA,随着纤维发育成熟及年代增加,所提取的DNA含量尽管有所降低,但仍能满足下游试验需求;所提取的棉纤维DNA可进行常规PCR扩增,且PCR扩增条带清晰;以13对棉花SSR引物对鲁1127、石抗126和瑞杂816棉纤维DNA进行SSR-PCR扩增,均可扩增出清晰的多态性谱带,且易于区分。【结论】该提取法适合提取棉花纤维的基因组DNA,且满足于常规PCR扩增和SSR分子标记。本研究证实基于棉纤维DNA分子标记用于棉花品种溯源切实可行,并有望为保障我国棉花产业安全提供技术支持。     

转基因作物深加工产品的DNA提取方法研究

由于转基因作物深加工产品中的DNA受到破坏,含量低、质量下降,提取困难,直接影响了后续的转基因定性检测。为解决这一难题,以酱油和番茄酱为样本进行了原料DNA提取方法的试验。针对酱油中添加大量焦糖色素和番茄酱偏酸的特点,通过加入样品预处理程序,有效地去除了酱油中的焦糖色素分子和调整了番茄酱沉淀的pH 值。利用大豆和番茄的内源特异参照基因进行PCR扩增,结果证明了利用该方法所提取的DNA完全能够满足转基因定性检测的需要,方法简单、快速、有效。     

转基因棉子油的快速PCR检测研究

 以棉子油为原料,探索出了一种快速、简便的转基因棉子油的PCR检测方法。该方法能从15 mL棉子油中提取0.4 μg高纯度DNA,用于PCR检测。针对18S rDNA、CaMV35S、NOS、NPTⅡ和Cry1A（c）等基因进行了棉子油中内外源基因PCR检测,分别扩增出不同的目的片段。本研究为油脂类产品的外源基因检测提供了可行方法。     

转基因玉米种子快速筛查方法的应用分析

在全面获取转基因玉米信息的基础上打造玉米转基因检测分子特征矩阵,根据元件信息打造转基因玉米筛查检测策略,就转基因玉米种子快速筛查方法的应用成效问题进行探究,经过试验研究发现DNA热碱提取方法和复合PCR技术结合能够提升转基因玉米筛查成效,提升玉米的产量。     

转植酸酶基因玉米phyA2基因标准质粒分子构建及其检测应用

质粒分子以其良好的适应性被较多地用作转基因标准材料的替代品。本文根据转植酸酶基因玉米phyA2基因设计引物与探针,并构建了一种包含phyA2基因片段(243 bp)和内标基因片段(178 bp)的质粒分子pPZ。选取不同转基因模板DNA作用于phyA2特异性引物,PCR结果显示只有转植酸酶基因玉米出现131 bp的目的条带;选取不同转基因作物检测体系作用于质粒分子pPZ,只有以pPZ DNA为模板时出现目的条带(131 bp和88 bp)。同时采用pPZ质粒分子和转基因玉米阳性基因组DNA为标准对4个转植酸酶基因玉米混合样品(3.0%、1.0%、0.5%和0.1%)进行定量检测,t检验表明,2种标准产生的斜率、线性相关系数和定值结果没有显著差异。这些结果表明,pPZ质粒分子可以作为转植酸酶基因玉米替代品用于定性和定量检测。     

抗病转基因水稻M12及其产品成分的定性、定量PCR检测方法

通过定性PCR扩增了转基因水稻M12转化体特异性片段和水稻内标基因(sps)片段, 将PCR产物酶切连接后构建到T载体, 得到适于转基因水稻M12品系特异性PCR检测的质粒分子pM12, 建立了事件特异性定性、定量PCR检测方法。定性PCR结果表明, 本方法可特异性检测出M12, 检测限可达100拷贝单倍体水稻基因组; 定量PCR结果表明, M12和sps定量PCR标准曲线R ²为0.998和0.997, 扩增效率为95.3%和108.4%, 重复性分析标准偏差范围为0.043~0.276, 定量极限和检测极限可达100和10拷贝。对转基因含量为1.0%的混合样品定量结果的相对偏差在8.0%以内。本研究建立的方法可用于转基因水稻M12及其加工产品成分的检测。     

双重荧光定量PCR杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MON89034

本研究创建一种简单快捷、成本低廉、灵敏准确及可靠性强的高通量鉴定转基因玉米MON89034转化体的快速检测方法。采用多重实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)对转基因玉米MON89034品系进行检测,并针对转基因玉米MON89034靶标基因设计高效稳定的引物和探针,使用zSSIIb基因作为内源基因,避免检测出现假阴性,将反应体系及条件优化后,用实时荧光定量PCR仪进行扩增,初步建立转基因玉米MON89034双重实时荧光PCR检测方法,通过对该方法进行特异性和大样本可靠性测试验证,继而创建出一种高通量鉴定转基因玉米MON89034转化体的检测方法。通过建立的双重荧光定量PCR方法对转基因玉米、非转基因玉米和转基因大豆的DNA混合模板检测得出的结果表明,多种作物DNA混合模板可在单根PCR反应管内实现对zSSIIb基因和MON89034的同时检测,并在2 h内完成检测得到准确结果。目前,建立的该双重实时荧光PCR方法可用于多个转基因作物样品间快速筛查,检测快速,结果准确,可满足大多数检测机构日常检测的需求。