草本纤维提取用菌株的PCR-16S rDNA及ITS-RFLP分析

通过分析从沤麻水中分离到的8株草本纤维提取用菌株的16S rDNA以及ITS序列,鉴定并构建其聚类图,明确草本纤维提取用菌株的遗传关系.通过BLAST比对16S rDNA并用限制性内切酶酶切16～23S的ITS保守序列,对参试菌株的16S rDNA及ITS酶切片段进行聚类分析.结果表明,8株菌株分别属于地表芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及多粘类芽孢杆菌:基于16S rDNA序列与ITS-RFLP所获得的聚类结果基本一致,菌株1251与菌株1172-1聚为一类,其余聚为一类,但种内聚类存在一定的差异,可能与不同类型的序列进化程度有关,8株菌株的16SrDNA序列的相似性为78.66%;Alu Ⅰ、Hinf Ⅰ、Sau3A Ⅰ、Taq Ⅰ 4种限制性内切酶对参试的8株草本纤维提取用产芽孢菌株的ITS进行酶切,各获得0～4条100～440bp的酶切产物.     

荷叶离褶伞遗传差异性分析及菌丝形态鉴定

【目的】比较荷叶离褶伞（Lyophyllum decastes,Lyd）外地引进菌株与本地栽培菌株的遗传差异性和菌丝形态特征，为荷叶离褶伞选育提供参考。【方法】以真菌18S rRNA(V4)和ITS(ITS1–ITS4)(18S rRNA-ITS)序列对外地引进和本地栽培的荷叶离褶伞进行序列同源性分析、多重序列比对和构建系统发育进化树，通过分析碱基序列突变和遗传距离远近明确荷叶离褶伞菌株间的亲缘关系，并通过菌丝体生长及形态变化确定荷叶离褶伞的遗传学差异。【结果】18S rRNA-ITS序列比对结果显示，外地荷叶离褶伞菌株（Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、LydLR15和Lyd-LR17）发生较高比例的碱基缺失和碱基替换突变，且ITS序列同源性下降至80.09%～89.72%; LydLR1和Lyd-LR6菌株的碱基突变比例高于Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17以及福建本地栽培菌株（Lyd-LRX和LydLRY）。进化树分析结果进一步显示，Lyd-LR1和Lyd-LR6与Lyd-LR10、 Lyd-LR15、 Lyd-LR17、 Lyd-LRX、 Ly...     

一株高效秸秆纤维素降解真菌的分离、鉴定及系统发育分析

通过刚果红染色法初筛,结合产酶活性测定复筛,从奶牛、山羊瘤胃内容物中分离到一株纤维素高效降解菌NL-3,克隆了该菌的18SrDNA序列,并以其同源性为基础构建了相关属种的系统发育树。结果表明,18SrDNA序列全长504bp,Blast显示该菌株与青霉菌属同源;NL-3菌株在进化关系上也与青霉菌属（Penicillium）聚成一族。特别是与Penicillium decumbens strain JU - A10的同源性最高,序列相似性达99％。结合菌株形态学及18SrDNA基因序列分析结果对菌株进行鉴定,初步鉴定为青霉属的斜卧青霉（Penicillium decumbens）。     

米氏凯伦藻18S rDNA和转录间隔区序列分析

对赤潮多发藻米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)核糖体18S rDNA及其转录间隔(ITS) 区序列PCR扩增并测序,获得18S rDNA和ITS基因序列长度分别为1 690 bp和654 bp.结合12种甲藻和1种硅藻作序列比较分析,分别在ITS1、ITS2序列寻找到适宜设计特异性引物探针区域,并用邻接法构建系统进化树,研究各藻种间亲缘关系.遗传距离分析结果显示米氏凯伦藻与短凯伦藻(Karena brevis)、微小卡罗藻(Karlodinium micrum )等分类学上较近的藻种18S rDNA序列相似度为97%～99%,远大于微小原甲藻(Prorocentrum minimum)、海洋原甲藻(P.micans)、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)等在分类学上相距较远的藻种,各藻种间的ITS序列平均相似度明显低于18S rDNA序列.以18S rDNA与ITS序列构建的进化树拓扑结构相一致,18S rDNA序列相对保守,适合进行属以上关系的系统进化分析,而ITS序列变异较大,适合种属间鉴别分析,且ITS1和ITS2是变异很大的区域,适合种间的分子特异性鉴定,这为快速鉴别赤潮多发藻米氏凯伦藻提供了依据,进而为治理赤潮提供帮助.     

冬虫夏草粉红菌株的分子鉴定

在冬虫夏草真菌培养过程中,菌株SH-1菌丝产生粉红色变化的现象,粉红菌株ZH-1与正常菌株SH形态存在很大差异。菌株SH-1与粉红菌株ZH-1的ITS序列比对鉴定结果表明,11株SH-1和2株ZH-1都能扩增出条带,条带清晰且稳定,分布在500~750 bp范围内,13株菌株在Gen Bank中应用Blast比对都与Paecilomyces sp.Cs-4(EU328187)的相似性达到了100%。用3种方法对13株菌株ITS序列与分离自冬虫夏草的32株真菌ITS序列(下载自Gen Bank)构建系统进化树,3种方法都显示13株菌株与蝙蝠蛾拟青霉分为1支,可以确定粉红菌株ZH-1与正常菌株SH-1为同一个种,即蝙蝠蛾拟青霉。     

四株马铃薯甲虫白僵菌菌株的鉴定

[目的]通过形态学特征明确四株马铃薯甲虫致病菌分类地位,探讨利用18S及ITS核酸序列鉴定四株致病菌的可行性.[方法]通过传统形态学特征及18S、ITS序列分别对四株马铃薯甲虫白僵菌1572、1573、1576和1577进行鉴定.[结果]孢子形态、产孢结构、菌落等形态学特征表明四菌株均为球孢白僵菌.四菌株18S rDNA序列分析获得1 665个共同碱基,在GenBank比对,从结果中选择相似度大于98;的序列与四菌株一起构建系统发育树I,发现白僵菌属归于一个分支,四菌株均归属于白僵菌属球孢白僵菌.剔除遗传关系比较远的、冗余的属外菌重新构建18S系统发育树Ⅱ,结果四菌株都与Beauveria bassiana(登录号为EU334676.1)分到一个枝上.ITS核酸序列分析获得513个共同碱基,在GenBank比对,显现的序列均属白僵菌属,下载这些序列与四菌株构建ITS系统发育树I,发现球孢与布氏白僵菌归属在一个分支.选取Stephen A.Rehner注册的白僵菌属六个分支的代表种及数据库中部分球孢和布氏白僵菌与四菌株一起构建ITS系统发育树Ⅱ,四菌株与代表种Cordyceps bassiana(AY532041.1)分到一个枝上,但在该枝上有三株布氏白僵菌,球孢与布氏白僵菌不能完全区分开.[结论]利用18S和ITS核酸序列均可将白僵菌鉴定到属,根据ITS序列可以确定四株白僵菌归属于球孢白僵菌的分支.     

新疆果树寄生线虫新纪录种—畸形轮线虫(Criconemoides informis)的鉴定

从新疆阜康市和库尔勒市的苹果及香梨根际土壤中分离到一种线虫,通过形态特征观察、形态测计,并提取DNA,扩增其18S rDNA、28S rDNA D2-D3和ITS区基因片段,利用NJ法构建系统进化树,进行种类鉴定。结果表明,供试线虫群体形态学特征与畸形轮线虫山东种群、荷兰种群测计值基本一致,构建的18S rDNA区、28S rDNA D2-D3区和ITS区序列系统进化树与NCBI上记录的畸形轮线虫聚为同一支。结合形态学特征与分子生物学特征,将该新疆线虫种群鉴定为畸形轮线虫(Criconemoides informis),也是该线虫在新疆果树上的首次报道。     

利用ITS核酸序列分析鉴定海洋青霉菌

[目的]利用ITS核酸序列对6株根据形态学特征初步鉴定为青霉菌的海洋真菌进行鉴定。[方法]采用分子生物学技术,对6株样品的ITS序列进行克隆,并利用ClustalX1．83软件对结果进行系统发育分析。[结果]通过PCR克隆获得了6株样品的ITS序列,将结果与GenBank中已登陆的其他序列进行系统发育分析,确定了6株菌株均属于青霉菌属。[结论]该6株菌株均属于青霉菌属。     

番木瓜棕榈疫霉核糖体DNA-ITS序列分析

采用真菌核糖体转录间隔区通用引物ITS1和ITS4,PCR扩增了2株分离自广州的番木瓜疫霉菌(Phytoph-thorasp.)的核糖体基因ITS序列,并对PCR产物进行了克隆测序.供试菌株C0506071、C0506072分别克隆出814 bp、830 bp的序列,两菌株ITS序列间的相似同源率为99.62%.将供试菌株的ITS序列与GenBank中登陆的20株疫霉菌株的ITS序列进行聚类分析,结果表明,供试菌株与GenBank注册的AF467093、AJ517463聚在同一分枝上,均为棕榈疫霉(Phytophthora palmivora),其他不同的疫霉种聚在不同的分支上,系统学关系较远.这表明分离自广州的2株番木瓜疫霉菌为棕榈疫霉(Phytophthora palmivora).     

柑橘采后青霉病原中寄生病毒的筛选与鉴定

【目的】从采后霉烂柑橘上分离青霉病原菌，并筛选和鉴定病原中寄生的青霉病毒。【方法】以柑橘园腐烂的柑橘为材料，挑取分生孢子在PDA培养基上进行划线分离，根据总基因组电泳图谱筛选具有基因组额外核酸片段的病毒菌株，并使用RT-PCR扩增额外片段测序鉴定相应病毒。【结果】根据菌落形态初步分组，分离到两类菌落特征差异明显的青霉菌(共25株),其中具灰绿色菌落的青霉16株，具暗黄绿色菌落的青霉9株。扩增两类青霉的代表菌株(DY10和DY18)的ITS并测序，鉴定结果显示，DY10和DY18分别为意大利青霉(Penicillium italicum)和指状青霉(P.digitatum)。青霉菌株总基因组电泳筛选发现，DY9、DY11、DY12、DY17菌株中存在约6000 bp的基因组额外片段，推测可能为指状青霉病毒1 (PdV1)同种不同病毒株的基因组。根据PdV1基因组设计特异性引物，RT-PCR扩增出约500 bp的条带，测序序列与PdV1基因组同源序列的一致性高达99.7%,将所分离的病毒鉴定为PdV1同种的不同病毒株。【结论】本研究从腐烂柑橘上分离鉴定意大利青霉16株和指状青霉9株，并从指...     

拮抗农业致病真菌放线菌株BOS-010的分离、抗菌活性及鉴定研究

采用稀释分离法得到28株放线菌,以20种农业常见致病真菌作为供试检测菌,采用抑制菌丝生长速率法对放线菌进行抗菌活性筛选,优选出BOS-010菌株作为目的生防菌.通过形态学、培养特征、理化指标检测,对BOS-010放线菌菌株进行初步鉴定;通过16 S rDNA序列比对,发现该菌株16 S rDNA与累西菲链霉菌(Streptomyces recifensis)16 S rDNA同源性达99％.根据多项分类原则和系统进化树的构建分析,确定该菌株归属累西菲链霉菌类.     

鲫鱼鳃中迟钝爱德华氏菌的分离与鉴定

以市售鲫鱼(Carassius auratus)为研究对象,从鳃中分离获得一株细菌,编号为Et-1,通过细菌形态学观察、理化特征鉴定、16S rDNA克隆测序及系统发育进化树构建等方法进行系统鉴定,结果表明Et-1菌株为革兰阴性杆菌,进一步PCR扩增Et-1菌株的16S rDNA序列为1 508 bp;系统进化树分析表明,Et-1菌株与迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)亲缘关系最近,自然聚为一支,序列同源性达98.7％～100％,最终确定Et-1为迟钝爱德华氏菌.     

面筋食品中微生物群落分析及优势菌分离鉴定

为探明面筋食品腐败变质的主要污染途径和微生物群落,从生产线、大型超市和零售小卖部多地取样,用平板计数法检测菌落总数、霉菌酵母数、耐热菌和大肠菌群数,用划线法和点接法将优势菌分离,通过形态观察和理化试验,结合16S rDNA序列和18S rDNA的ITS区域序列进行优势菌鉴定。结果显示:小卖部样品的细菌总数达8×10~4 CFU/g,酵母霉菌数达1.20×10~3 CFU/g,都大大超过地方标准上限的数倍,其他样品的微生物数量均在地方标准之内,说明挤压熟化工艺有较好的杀菌效果,后期生产销售是造成污染的主要途径;分离优势菌得2类细菌12株,3类霉菌8株;2类细菌的代表菌为粪嗜冷杆菌(Psychrobacter faecalis)、黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva),3类霉菌的代表菌为溜曲霉(Asperqillus tamarii)、灰黄青霉(penicilium griseofulvum)和黑曲霉(Asperqillus niger)。     

平菇培养料青、绿霉菌的分离鉴定及特性

从南宁市平菇栽培原料、污染菌包、污染菌种和霉变子实体中分离青、绿霉菌,获得菌株47个,采用形态学比较观察和rDNA ITS1-5.8S-ITS2基因片段进行序列分析,结果共鉴定出侧耳木霉、绿色木霉、哈茨木霉、桔青霉、托姆青霉和短密青霉6个种.6个菌株均在40℃以上死亡,湿度在40％以下不能生长,pH值高抑制其生长.     

基于rDNA序列分析的3种丛枝菌根真菌分子鉴定方法比较

【目的】比较基于rDNA序列分析的3种丛枝菌根（AM）真菌分子鉴定方法,为提高AM真菌在种水平分子鉴定的准确性提供参考。【方法】对从柑橘和甘蔗等广西地区主要作物的根际土壤中分离出的AM真菌菌株（编号为A6、B3和GY3-1）进行形态学鉴定,再通过巢式PCR分别扩增AM真菌的18SrDNA、28Sr DNA及含ITS1、5.8SrDNA和ITS2的序列（简写为ITS1+5.8S+ITS2）,分别将其测序结果与GenBank数据库进行比对,并构建系统发育进化树,再结合形态学鉴定结果比较基于3个r DNA序列分析分子鉴定方法的准确性。【结果】菌株A6、B3和GY3-1的形态特征分别与幼套近明球囊霉（Claroideoglomus etunicatum）、黏质隔球囊霉（Septoglomus viscosum）和摩西斗管囊霉（Funneliformismosseae）一致。基于18SrDNA序列,将菌株A6鉴定为近明球囊霉属（Claroideoglomus）,菌株GY3-1鉴定为摩西斗管囊霉（F. moessae）,菌株B3鉴定为黏质隔球囊霉（S. viscosum）。基于28S rDNA序列...     

酸马奶中酵母菌5.8 S rDNA及ITS的基因序列分析

实验将两株从酸马奶中分离提纯的酵母菌,提取单菌株基因组DNA,用一对真菌通用引物ITS1和ITS4 PCR 扩增它们的5.8S rRNA和ITS基因,连接入pMD19-T载体,克隆鉴定后,测定序列,将测得的序列与GenBank数据库的序列进行同源性分析,并建立系统进化树.结合系统发育树及5.8 S rDNA和ITS的序列分析结果,将菌株J14和S33判定为Kluyveromyces marxianus(马克斯克鲁维酵母).酸马奶中传统的酵母菌分类主要依靠形态学和生理生化等鉴定方法,实验首次利用5.8S rRNA和ITS基因扩增和测序的分子生物学方法对其进行鉴定.     

基于16S rDNA序列的1株灭螺微生物的分子鉴定

从湖南省汨罗市血吸虫防治基地土壤中分离得到1株灭螺活性较强的微生物菌株B59,以B59菌株的总DNA为模板,采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增并测其核酸序列,得到1条约1 500 bp的片段。通过Blast软件在Gen Bank中进行同源性检索,将其与同源性较高的菌株的ITS序列进行Clustal X序列差异和同源性分析,分别使用MEGA 6.0软件中的邻接法、Phylip软件中的最大简约法及最大似然法构建系统发育树。结果显示,3种方法构建的系统发育树基本一致,B59菌株与Bacillus cereus的亲缘关系最近,聚为一支,相似度达100%。     

拮抗放线菌111A202的种类鉴定及其16S rDNA序列分析

对分离自药用植物假橐吾的一株拮抗放线菌菌株111A202进行了形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁组分分析及16 S rDNA序列分析.结果表明该菌基内菌丝无横隔、不断裂,气生菌丝分枝、孢子丝波曲,孢子椭圆形,表面光滑.细胞壁化学组分Ⅰ型.以16 S rDNA序列为基础构建了包括7株相关种属菌在内的系统发育树,111A202与变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、微白黄链霉菌(S.albidoflavus)的16 SrDNA序列的相似性达到99.5%和99.6%.根据以上多相分类结果,放线菌111A202的形态培养特征及其细胞组分与链霉菌一致,且与微白黄链霉菌近似性很高,因此,可以将放线菌111A202定名为微白黄链霉菌111A202(S.albidoflavus 111A202).     

基于ITS序列分析18个茶树菇菌株的亲缘关系

采用ITS序列分析方法,对供试18株(4株野生菌株、7株工厂化栽培菌株、5株经钴60辐照诱变菌株和2株搭载神十的航天诱变菌株)茶树菇菌株进行研究。结果表明,供试菌种的ITS序列长度为703~721 bp,与Gen Bank数据库中茶树菇菌种的ITS序列相似度为99%以上,在种的水平上证明供试菌种为茶树菇。运用构建的系统发育树将供试菌种聚为6个类群,其中Cha3与Cha3shen,AS-2与AS-2-600,AS-1与AS-1shen、AS-1-700,分别聚在了不同的类群,说明这7株茶树菇菌株可能由于辐照或航天诱变后使得ITS序列存在着种内的变异。ITS序列分析结果从系统发育角度反映出了研究菌株的遗传关系,是进行茶树菇菌株遗传分析及科学鉴定的重要工具。     

竹材木质素选择性降解菌株的分子鉴定

鉴定1株从腐竹中筛选的高效选择性降解竹材木质素的优良菌株ZNLD-18,为生物法提取可纺性竹原纤维奠定基础。利用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增并测定菌株的rDNA ITS区序列,序列总长541bp。把所得序列在GenBank中进行B1ast搜索得到同源性较高的同属不同种菌株序列。比较这些序列的遗传距离,显示菌株ZNL D～18与Trametes versicolor的ITS区序列同源性为99％以上。利用PAUP软件构建分子系统发育树,通过对该树的分析并综合菌株的形态特征,鉴定菌株ZNLD-18为白腐菌Trametes versicolor。