海豚链球菌重组C5a肽酶对斑点叉尾鮰的免疫保护性研究

采用饱和硫酸铵法对斑点叉尾鮰IgM进行粗提,用亲硫树脂对IgM进行纯化,将纯化的IgM免疫家兔,并用ELISA检测兔抗斑点叉尾鮰IgM抗体效价;制备重组C5a肽酶(pSCPI),分别用1、2和3 μg/g的抗原免疫斑点叉尾鮰,以PBS作为对照;测定了第21、28、35、42和49天斑点叉尾鮰产生的特异性抗体的水平,并于免疫后第4周用海豚链球菌DGX07株进行攻毒。结果显示:通过亲硫树脂亲和层析后得到了较纯的IgM重链和轻链,分别约70 ku和27 ku,浓度达到6.4 mg/mL,免疫家兔后的兔抗斑点叉尾鮰IgM抗体效价达1∶51200;重组蛋白pSCPI免疫斑点叉尾鮰后第3周抗体水平开始增加,第4周达到峰值,第5周后开始下降,且3 μg/g浓度组第4周抗体水平最高,但与2 μg/g浓度组第4周抗体水平差异不显著;攻毒实验显示,3个组14 d平均累计死亡率分别为 47.5%、45%和47.5%,平均相对保护率分别为40.63%、43.75%和40.63%,且死亡鱼体内分离到唯一海豚链球菌。以上结果表明重组pSCPI蛋白具有较好的免疫保护作用,能够作为海豚链球菌亚单位疫苗的候选之一。     

斑点叉尾(鱼回)鱼皮胶原的研究

从斑点叉尾鱼回鱼皮中提取酸溶和酶溶胶原并对其进行了部分定性研究。实验中获得的胶原中甘氨酸最为丰富,质量分数超过23%,酸溶胶原的变性温度为32.5℃,比猪皮胶原的变性温度低5℃。SDS-PAGE实验结果表明酸溶胶原至少有2条不同的α链。酸溶胶原和酶溶胶原分别占原料干基的25.8%和38.4%,可以作为猪皮、牛皮胶原的替代品。     

网箱培育斑点叉尾(鱼回)大规格鱼种试验

在水库上设置4只网箱,放养全长5.3～6.0cm的斑点叉尾(鱼回),投喂粗蛋白含量为34.57%的配合饲料,饲养期56d,斑点叉尾(鱼回)规格达16.1cm.鱼种试验成活率92.67%,总利润16100.8元,饲料系数2.15,投入产出比1∶1.93.     

斑点叉尾(鱼回)血清免疫球蛋白纯化及其结构分析

通过饱和硫酸铵分步盐析结合柱层析纯化温和气单胞菌免疫的斑点叉尾(鱼回)血清免疫球蛋白(Ig),结果表明,斑点叉尾(鱼回)血清Ig主要分布在35%～55%的硫酸铵沉淀区间;而在Sepharose-4B凝胶柱和DEAE-52阴离子交换柱层析纯化的Ig均出现在第1个蛋白质峰.SDS-PAGE分析表明,纯化后的血清Ig纯度提高.通过变性还原、变性非还原和非变性非还原3种条件下的免疫印迹(Western blot)试验对血清Ig的结构进行初步分析,发现SDS变性还原条件下血清Ig重链分子量为72 kD,轻链有3条,其分子量分别为21 kD、23.5 kD和26 kD;在变性非还原条件下血清Ig则出现多种结构形式,主要条带的分子量分别为760 kD、525 kD、330 kD和230 kD;而在非变性非还原条件下Ig仅出现一种结构形式,分子量约为870 kD.     

AQUAVAC-ESC疫苗免疫预防斑点叉尾(鱼回)(Ictalurus punctatus)肠道败血症的田间试验

应用AQUAVAC-ESC疫苗在中国广西进行斑点叉尾(鱼回)肠道败血症的免疫预防试验,以评估该疫苗的效能.结果表明,疫苗对鱼苗是安全的.AQUAVAC-ESC灵敏度高,鱼苗阶段就能刺激鱼的免疫系统产生特异性抗体.合理使用AQUAVAC-ESC可以提高饲料转化率,降低生产成本.     

斑点叉尾鮰暴发性海豚链球菌病的研究

于2006—2007连续两年在广西横县、邕江及合浦等网箱养殖的斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus中暴发一种流行性传染病,该病波及面广、传染性强,死亡率为30%¹00%。鱼的主要发病症状为:浮头、转圈、狂游,发病后期鱼的单边眼睛浑浊、突出,且全身大面积弥漫性出血。作者先后从症状较为典型的斑点叉尾鮰的脑、肝脏、脾脏和肾脏组织等部位取样,分离到7株代表性菌株(CMS003100%。鱼的主要发病症状为:浮头、转圈、狂游,发病后期鱼的单边眼睛浑浊、突出,且全身大面积弥漫性出血。作者先后从症状较为典型的斑点叉尾鮰的脑、肝脏、脾脏和肾脏组织等部位取样,分离到7株代表性菌株(CMS003^CMS005、CMS009CMS005、CMS009^CMS012)。人工感染试验结果表明,分离菌株对健康斑点叉尾鮰具有很强的致病力,发病症状与自然发病斑点叉尾鮰的症状相同。采用常规形态、生理生化及海豚链球菌Streptococcus iniae特异性PCR诊断和16S rRNA基因序列系统发育进化分析的方法,对分离菌株进行分类鉴定,结果表明,分离的7株细菌均为海豚链球菌。目前,海豚链球菌已成为广西斑点叉尾鮰网箱养殖的高致病性病原菌。     

斑点叉尾鮰暴发性海豚链球菌病的研究

于2006-2007连续两年在广西横县、邕江及合浦等网箱养殖的斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus中暴发一种流行性传染病,该病波及面广、传染性强,死亡率为30%～100%.鱼的主要发病症状为:浮头、转圈、狂游,发病后期鱼的单边眼睛浑浊、突出,且全身大面积弥漫性出血.作者先后从症状较为典型的斑点叉尾鲴的脑、肝脏、脾脏和肾脏组织等部位取样,分离到7株代表性菌株(CMS003～CMS005、CMS009～CMS012).人工感染试验结果表明,分离菌株对健康斑点又尾鮰具有很强的致病力,发病症状与自然发病斑点叉尾鮰的症状相同.采用常规形态、生理生化及海豚链球菌Streptococcus iniae特异性PCR诊断和16S rRNA基因序列系统发育进化分析的方法,对分离菌株进行分类鉴定,结果表明,分离的7株细菌均为海豚链球菌.目前,海豚链球菌已成为广西斑点叉尾鮰网箱养殖的高致病性病原菌.     

斑点叉尾细暴发性海豚链球菌病的研究

于2006-2007连续两年在广西横县、邕江及合浦等网箱养殖的斑点叉尾鲴Ictalurus punctatus中暴发一种流行性传染病,该病波及面广、传染性强,死亡率为30％～100％。鱼的主要发病症状为：浮头、转圈、狂游,发病后期鱼的单边眼睛浑浊、突出,且全身大面积弥漫性出血。作者先后从症状较为典型的斑点叉尾鱼心的脑、肝脏、脾脏和。肾脏组织等部位取样,分离到7株代表性菌株（CMS003～CMS005、CMS009～CMS012）。人工感染试验结果表明,分离菌株对健康斑点叉尾鲴具有很强的致病力,发病症状与自然发病斑点叉尾鲴的症状相同。采用常规形态、生理生化及海豚链球菌Streptococcus iniae特异性PCR诊断和16S rRNA基因序列系统发育进化分析的方法,对分离菌株进行分类鉴定,结果表明,分离的7株细菌均为海豚链球菌。目前,海豚链球菌已成为广西斑点叉尾鲴网箱养殖的高致病性病原菌。     

海豚链球菌重组C5a肽酶对斑点叉尾的免疫保护性研究

采用饱和硫酸铵法对斑点叉尾IgM进行粗提,用亲硫树脂对IgM进行纯化,将纯化的IgM免疫家兔,并用ELISA检测兔抗斑点叉尾IgM抗体效价;制备重组C5a肽酶(pSCPI),分别用1、2和3μg/g的抗原免疫斑点叉尾,以PBS作为对照;测定了第21、28、35、42和49天斑点叉尾产生的特异性抗体的水平,并于免疫后第4周用海豚链球菌DGX07株进行攻毒。结果显示:通过亲硫树脂亲和层析后得到了较纯的IgM重链和轻链,分别约70ku和27ku,浓度达到6.4mg/mL,免疫家兔后的兔抗斑点叉尾IgM抗体效价达1∶51200;重组蛋白pSCPI免疫斑点叉尾后第3周抗体水平开始增加,第4周达到峰值,第5周后开始下降,且3μg/g浓度组第4周抗体水平最高,但与2μg/g浓度组第4周抗体水平差异不显著;攻毒实验显示,3个组14d平均累计死亡率分别为47.5%、45%和47.5%,平均相对保护率分别为40.63%、43.75%和40.63%,且死亡鱼体内分离到唯一海豚链球菌。以上结果表明重组pSCPI蛋白具有较好的免疫保护作用,能够作为海豚链球菌亚单位疫苗的候选之一。     

斑点叉尾鮰致病菌株的鉴定及特性

菌株IP0004是从患病斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus肝脏中分离出的一株致病菌。经形态学观察、生理生化特性分析和16S rRNA基因序列测定分析对其进行分类鉴定,确定其为类志贺邻单胞菌Plesiomonasshigelloides。该菌为革兰氏阴性杆菌,极生单鞭毛,无芽孢,有荚膜;发酵葡萄糖、麦芽糖、海藻糖产酸,鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、β-半乳糖甙酶、α-半乳糖甙酶为阳性;其生长盐度为0~25,pH值为5~10,最适生长温度为37℃。菌株IP0004 16S rRNA基因部分序列与类志贺邻单胞菌16SrRNA相应基因序列的同源性均大于99%,构建的系统进化树显示该菌株与类志贺邻单胞菌聚为一类。菌株IP0004的细胞毒性外膜蛋白COMP（cytotoxic outer-membrane protein）基因与类志贺邻单胞菌的COMP基因序列相似性大于99.9%,说明该菌株为类志贺邻单胞菌,具有COMP基因,有一定的致病力。药物敏感试验结果表明,菌株IP0004对头孢曲松、头孢拉定、头孢唑林、氧氟沙星敏感,而对新生霉素、利复平、复方新诺明不敏感。     

斑点叉尾鮰套肠症的病原鉴定及其药敏特性

从患败血症并出现肠套叠的斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus肝脏、肾脏及脑组织中分离到一株细菌（TE090214）,经人工感染试验证实,该菌为斑点叉尾鮰病鱼的病原且具有高度致死性。对分离菌进行了形态特征、理化特性等较系统的表观分类学特征鉴定。结果表明：该菌经革兰氏染色为阴性,形状为两端钝圆的短杆菌,无荚膜及芽孢,氧化酶阳性,鸟氨酸脱羧酶阴性;能发酵葡萄糖产气,能利用甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖和水杨苷产酸,能水解七叶苷等。对该菌的16SrDNA进行PCR扩增、克隆测序,得到1条长度为1537bp的核苷酸序列（GenBank登录号GQ184148）;在以该菌16SrDNA序列和GenBank数据库内同源性较高的细菌16SrDNA序列构建的系统发育树中,菌株TE090214与嗜水气单胞菌Aeromonashydrophi—Zo聚在一簇,结合形态及生理生化特点,可将该菌株鉴定为嗜水气单胞菌。药敏试验结果显示：在供试的15种抗菌药物中,菌株TE090214对头孢哌酮、卡那霉素、氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星敏感,对链霉素、阿米卡星、复方新诺明中度敏感,对氨苄青霉素等7种药物存在不同程度的耐药性。     

不同水温下盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆的药代动力学研究

研究不同水温(18、28 ℃)条件下盐酸氯苯胍(robenidine hydrochloride,ROBH)在斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)血浆的药代动力学特征。以20 mg·kg^-1体质量剂量的盐酸氯苯胍单次口灌斑点叉尾鮰,采用高效液相色谱-串联质谱法测定血浆中盐酸氯苯胍的浓度,内标法定量,并采用3p97药代动力学软件计算药代动力学参数、开展模型分析。结果表明,在不同水温条件下盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆的药时曲线均符合二室模型特征,动力学方程分别为C_{18 ℃}=4.17e^-0.01t+2.48e^-0.008t-6.65e^-0.05t和C_{28 ℃}=7.69e^-0.02t+0.13e^-0.01t+-7.82e^-0.27t。血浆中盐酸氯苯胍达峰时间T_peak 分别为42.36和10.03 h,峰浓度值C_max分别为3.51和5.76 μg·mL^-1,表观分布容积V/F(c)分别为3.79和2.78 L·kg^-1,分布相的一级速率常数α分别为0.248和0.222 h^-1,消除相的一级速率常数β分别为0.006和0.007 h^-1,吸收半衰期T_1/2(ka)分别为14.67和2.54 h,消除半衰期T_1/2(β) 分别为85.52和58.63 h,中央室向周边室转运的一级速率常数K₁₂分别为0.000 2和0.000 2 h^-1,周边室向中央室转运的一级速率常数K₂₁分别为0.009和0.01 h^-1,药-时曲线下面积分别为554.18和326.74 μg·mL^-1·h^-1。研究结果表明,盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体血浆的吸收、分布和消除受水温的影响显著,高水温条件下盐酸氯苯胍的达峰时间短,峰浓度值约是低水温时的2倍,水温对血药曲线下面积的影响较大,对肾清除率影响不大。研究结果为盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰养殖过程中不同季节的合理使用提供一定理论依据。     

敌百虫对斑点叉尾鮰的急性毒性试验

[目的]了解敌百虫对斑点叉尾鮰的急性毒性情况。[方法]以健康斑点叉尾鮰鱼种为试材,平均体重46.7 g,敌百虫设6个浓度梯度(0.1、0.4、0.8、1.2、2.4和3.2 mg/L),在室内常温静水条件下,对斑点叉尾鮰进行急性毒性正交试验。[结果]敌百虫对斑点叉尾鮰的24、48、72、96 h的半致死浓度分别为1.6、1.1、0.8、0.7 mg/L;安全浓度0.07 mg/L。敌百虫毒性强,使用时必须等毒性消失后才能放鱼苗;不同鱼类对敌百虫敏感性有差异很大,斑点叉尾鮰对敌百虫非常敏感,浓度为0.8 mg/L时已有将近50%的鱼死亡,而未死亡的鱼也表现出不同的中毒症状;大剂量使用不仅会出现残留、阻碍鱼类生长,而且还会污染水质。[结论]建议生产上敌百虫与其他药物轮用,使用时须等毒性消失后使用。     

斑点叉尾鮰生物学特性及人工养殖

阐述了斑点叉尾鮰的生物学特性及人工养殖技术。     

斑点叉尾鮰鱼肠蛋白酶的分离纯化及其酶学性质

以斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus鱼肠道为原料提取蛋白酶,对分离条件进行了优化,并对部分酶学性质进行了研究。结果表明：鱼肠内的蛋白酶在硫酸铵饱和度为70%时,所得沉淀中酶活力最高。经过阴离子交换层析分离后,蛋白酶的纯化倍数达到了218倍。该蛋白酶的最适温度为55℃,最适pH为7.5,具有良好的低温稳定性和酸碱稳定性,米氏常数为5.4 g/L。K^＋和Ca^2＋离子对该蛋白酶活性有较弱的激活作用,Mg^2＋则能显著激活蛋白酶活性;Na＋和Zn2＋对蛋白酶的活性有较弱抑制作用,而Cu^2＋和EDTA能显著抑制蛋白酶活性。     

斑点叉尾鮰细菌性病原的分离与鉴定

报道从湖北省宜都市和长阳土家族自治县内清江河内养殖网箱中患病斑点叉尾鮰体内和体表分离致病菌的初步鉴定结果。从患病斑点叉尾鮰上共分离19个菌株,经分别采用注射和浸泡法人工感染试验,证明其中11个菌株能导致试验鱼80%~100%的死亡。根据对菌株的形态和生化特性的测定结果,11个菌株中的BH-001、BH-005、BH-009和BH-011等4个菌株属于叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri),而BH-002、BH-015、BH-017和BH-019等4个菌株属于嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。而BH-004、BH-013和BH-016等3个菌株尚未能鉴定其种类。     

罗非鱼海豚链球菌PCR检测方法的建立

为建立准确快速的海豚链球菌鉴定方法,设计合成了海豚链球菌种特异性引物CM1/CM2,进行了其特异基因片段的PCR扩增、反应条件的优化及方法的特异性和敏感性试验;同时还进行了不同检测材料的比较及9份临床样品检测.结果表明,引物CM1/CM2只能从海豚链球菌中扩增到特异性基因片段,供试的其它9种水产常见病原菌PCR扩增均呈阴性;能够检测的最低细菌数在20～30个细菌;方法可直接从病鱼的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织检测到该菌;另外,临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析结果一致.该方法弥补了传统细菌鉴定很难将该菌鉴定到种的缺点,并显著缩短了检测时间及降低了检测成本,具有较好的应用前景.