猪圆环病毒2型PCR快速检测方法的建立

根据GenBank公布的猪圆环病毒2型保守序列设计了一对引物,建立了检测猪圆环病毒2型PCR方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该PCR方法对猪圆环病毒2型的扩增结果为阳性,而对对照毒株的扩增结果均为阴性;对猪圆环病毒2型检测的灵敏度为1pg总DNA量。以上结果表明该PCR方法特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪圆环病毒2型的早期确诊和病毒鉴定。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

根据GenBark中登录的猪圆环病毒2型基因序列,应用PrimerPremier5.0设计筛选一对扩增ORF2基因引物,建立从猪病料中直接检测PCV2感染的PCR方法。扩增PCV2阳性样品出现一条447bp的特异性DNA条带,扩增产物测序结果证实为PCV2ORF2基因序列。应用本方法扩增猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等常见猪病原均未出现特异性条带,表明方法特异;敏感性试验结果表明,样品DNA模板检测浓度可达到9.8×10-4ng/μL;重复性和稳定性试验结果表明,用本试验建立的PCR方法进行PCV2检测,结果稳定可靠。经病猪临床检测应用,在66份病猪样本中,PCV2感染阳性率为27.27%,且多与PRRSV、PRV、HCV、PPV等一种或多种病毒混合感染,混合感染比例达72.22%。     

猪圆环病毒2型套式PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登录的猪圆环病毒2型(PCV2)的全基因组序列，设计了2对引物．建立了检测PCV2的套式PCR方法。对该方法用序列分析、酶切等方法进行了鉴定。同时用该套式PCR方法对华南地区287个猪场的1560份样品进行了检测，结果，983份为PCV2阳性，阳性率为63％。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及其应用

参照国内外已发表的猪圆环病毒2型（PCV-2）的ORF1的基因序列及其相关的PCR检测方法设计一对引物,扩增目的片段为493bp。通过对PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验,建立了一种PCV-2的PCR检测方法。应用此方法对临床样品进行了检测,阳性检出率达51.18%。该方法具有快速、敏感、特异等优点,可用于PCV-2的检测和流行病学调查等。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

为了研究猪圆环病毒2型(PCV-2)的分子生物学检测方法,试验根据GenBank中PCV-2的序列设计1对特异性引物,用PCR方法扩增猪PCV-2基因保守区序列,并对PCR扩增程序进行优化,对PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性进行研究;并用该方法对来自红河州规模化猪场的178份临床发病猪的肺脏和淋巴结样品进行检测。结果表明:该法具有快速、敏感、特异等优点,可用于PCV-2的检测和流行病学调查等;178份临床病料中有83份阳性样品,阳性率为46.6%。     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立

猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新的猪圆环病毒,与猪皮炎和肾病综合征、母猪繁殖障碍及心脏和多系统炎症相关。为了建立一种同时快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)和PCV3的双重PCR方法,根据GenBank收录的PCV2和PCV3基因序列,分别在PCV2 Cap基因和PCV3 Rep基因高度同源保守区设计并筛选2对特异性引物,经过双重PCR反应条件的优化,建立了同时检测PCV2/3的双重PCR检测方法。本方法可同时扩增出PCV2、PCV3的486,270bp特异性片段,而扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)等病原核酸结果均为阴性;PCV2/3最低检出量分别为139,21.7拷贝/μL。经临床应用表明,本试验建立的双重PCR方法简便、快速,敏感度高,特异性强,为PCV2/3的鉴别诊断和联合检测提供了依据。     

猪圆环病毒2型和3型双重荧光PCR检测方法建立及应用

猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属,目前基因型分为PCV1、PCV2、PCV3和PCV4.但在临床上,PCV2和PCV3流行较多,且鉴于PCV2和PCV3高度相似的临床特征,因此,建立一种快速、可靠的可同时检测PCV2和PCV3的方法,对PCV的临床诊断和流行病学调查意义深远.本研究利用生物信息学软件,设计2对引物和2...     

猪圆环病毒2型竞争定量PCR检测方法的建立及应用

根据猪圆环病毒2型(PCV2)BF的序列设计引物,扩增472 bp的ORF2部分基因片段,并克隆到pGEM-T载体中,构建含PCV2-ORF2部分基因片段的重组质粒.利用Xba I限制性内切酶消化后获得共用同1对引物但缺失196 bp的竞争重组子.通过重组质粒与竞争重组子间的竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立猪PCV2-ORF2的标准竞争曲线和直线回归方程,并对PCV2试验感染猪血清中PCV2核酸的动态变化进行了研究.     

多重PCR快速检测猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型方法的建立

根据GenBank上猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）的已知序列,利用Primer Premier 5.0及DNAstar软件对上述病毒基因保守区进行引物设计,选出扩增序列为PRV gB基因373 bp、PCV2 ORF2基因430 bp两对引物。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了PRV-PCV2两重PCR检测方法。敏感性及特异性试验结果显示,该mPCR对2种病毒的核酸检测可至1.47×10-6~1.62×10-6 ng,而对灭菌双蒸水、猪细小病毒（PPV）猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）多重PCR的扩增结果均为阴性,作为临床上猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型感染的病原学快速诊断方法具有可行性。     

猪圆环病毒2型及3型快速二重PCR检测方法的建立及其应用

针对猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)基因的保守序列设计了2对扩增PCV2和PCV3的特异性引物,通过优化各反应条件,建立同时检测PCV2和PCV3的二重PCR检测方法。敏感性和特异性结果显示,1.08×10~(-8)μg/μL是对PCV2和PCV3的最低检测限具有较好的灵敏度;而对猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、大肠杆菌、链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的检测结果均无条带,表明所建立的方法具有较好的特异性。应用该方法检测了2017年9月—2018年8月从广西14个地市猪场采集的533份病猪死猪内脏组织,结果显示:PCV2阳性率为23.8%,PCV3阳性率为14.8%, PCV2和PCV3混合感染率为2.8%。广西14个地市中有12个地市的猪场送检样品检测出PCV2,有10个地市的猪场送检样品检测出PCV3,表明PCV2和PCV3在广西受检猪群中普遍存在,要重视和做好PCV2和PCV3感染的防控工作。     

猪圆环病毒2型巢式PCR检测方法的建立与初步应用

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)给养猪业造成了重大的经济损失,建立经济、快速的检测方法尤为重要。本研究旨在利用巢式PCR技术,建立高灵敏度PCV2检测平台,以加强对猪圆环病毒病的防控。根据PCV2 ORF2基因保守区,设计内、外2对巢式PCR引物,通过优化PCR反应条件,建立巢式PCR检测方法,并对猪场临床样本进行检测。结果显示,本研究建立的巢式PCR检测方法灵敏度高、重复性强,最低检出量为10拷贝/μL,检出率达97.3%。本研究建立的巢式PCR检测方法为快速、高效地检测PCV2以及为猪圆环病毒病的防控提供有力手段。     

猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释质粒pMD-ORF2(含PCV2-ORF2全基因)为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪圆环病毒2型(PCV2)的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109~100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×106、1.0×105、1.0×104拷贝/μL的标准品的最终实际测得值分别为1.000×106、0.935×105、0.987×104拷贝/μL,变异系数分别为2.527%、2.067%、2.092%。该方法的检测灵敏度与套式PCR(nPCR)相当,甚而高于常规PCR。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登录的PCV2的保守序列,设计1对引物,建立了PCV2的PCR检测方法。试验结果表明,该PCR方法敏感、特异,适于临床样品检测,为PCV2的临床诊断和流行病学调查奠定了基础。     

猪圆环病毒2型感染的PCR检测

对山东省日照市某规模化猪场发现的患有断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)典型症状的病猪,采用针对猪圆环病毒2型(PCV2)开放阅读框2(ORF2)设计的特异性引物进行PCR检测,从病猪的组织样品中检测PCV2。从10头发病猪的组织样品中检测PCV2,结果有7头呈阳性结果。     

猪圆环病毒2型感染的PCR检测

对山东省日照市某规模化猪场发现的患有断奶仔猪多系统衰弱综合征（PMWS）典型症状的病猪,采用针对猪圆环病毒2型（PCV2）开放阅读框2（ORF2）设计的特异性引物进行PCR检测,从病猪的组织样品中检测PCV2。从10头发病猪的组织样品中检测PCV2,结果有7头呈阳性结果。     

猪捷申病毒与猪圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立可同时检测猪捷申病毒（PTV）与猪圆环病毒2型（PCV2）的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上2种病毒的PCR诊断方法,扩增片段长度分别为187bp（PTV）、120bp（PCV2）。通过实验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对PTV、PCV2核酸检测最低浓度分别为2．8×10^-2ng和6．6×10^-3ng。应用该方法对43份临床样品进行检测发现,PTV阳性率为23％,PCV2阳性率为38％,PTV与PCV2共感染率为16％。该方法的成功建立,为快速高效地检测以上2种病毒提供有力手段。     

非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型三重PCR检测方法的建立

为建立可同时鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)以及猪圆环病毒2型(PCV2)、3型(PCV3)的三重PCR方法,根据GenBank中登录的ASFV、PCV2、PCV3相关基因保守序列,分别设计合成特异性引物,通过对引物浓度、退火温度、循环数等反应条件进行优化,建立了针对3种病原的三重PCR检测方法,并开展了敏感性、特异性及重复性试验。结果显示:引物最佳终浓度为0.375 pmol/μL,最佳退火温度为61℃,最佳循环数为35;该方法对ASFV、PCV2、PCV3的扩增目的条带分别为873、530和217 bp,对猪细小病毒和伪狂犬病病毒的扩增结果均为阴性;对ASFV、PCV2、PCV3重组质粒标准品的检出下限均为1×10⁴ copies/μL;相同条件下重复性试验获得均匀一致的结果。结果表明,本研究建立的三重PCR检测方法具有特异性强,敏感性及重复性好等优点,可用于ASFV、PCV2和PCV3感染的快速鉴别诊断及流行病学调查。     

猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立及应用

本试验旨在建立一种针对猪圆环病毒2型(PCV2)和猪肺炎支原体(Mhp)的双重PCR检测方法.对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、沙门菌、大肠杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌基因组模板进行PCR特异性检测,没有任何非特异性扩增.敏感性试验显示,建立的PCR检测方法能够检测到的PCV2和Mhp模板的最低浓度分别为130和180fg·mL-1.同时用单项PCR和双重PCR对湖北省的各大猪场的174份PRDC样品进行检测,PCV2和Mhp的符合率分别达到100％和98.28％.进一步应用双重PCR调查PCV2和Mhp在不同猪场的感染动态,结果显示有一定比例的仔猪在产房就已经感染PCV2和Mhp,大部分猪是在保育和育肥阶段被感染 ;但是不同猪场表现出不同的感染动态.本试验建立了一种针对PCV2和Mhp的双重PCR检测方法,具有良好的特异性、敏感性,为临床疾病检测和疾病流行态势调查提供了有力的支持.     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

根据Genbank中PCV2全基因组序列设计了扩增片段大小为262bp的引物P1/P2,建立了检测猪圆环病毒2型PCR方法。引物对P1/P2从PCV2阳性病毒感染基因组中扩增出特异性条带的最低DNA含量为10-9ng/mL(约100个PCV2病毒)。用该方法对陕西和甘肃的103份临床发病猪的肺脏和淋巴结样品进行检测,结果有68份样品检测出阳性,阳性率为66%。     

猪圆环病毒2型和弓形虫双重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）和弓形虫（Toxoplasma gondii）的双重PCR方法,根据GenBank上已登录的PCV2和弓形虫基因的保守序列,设计了2对特异性引物,并对反应体系及条件进行了优化。首先对单一PCR检测条件进行摸索,确定其最佳检测条件和灵敏性;进而建立两种病原的双重PCR检测方法,通过对退火温度、灵敏性和特异性进行测试,最终确定该方法的反应体系及条件。结果显示：双重PCR方法对PCV2和弓形虫的最低检出限分别为78.16和29.19 μg/mL;对伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪瘟病毒（CSFV）等均无扩增,特异性良好。利用该方法对来自川渝地区部分猪场的63份临床样本进行检测,并与单一PCR检测结果进行比对,两种方法的符合率为100%。以上结果说明,本试验建立的双重PCR方法灵敏度高、特异性强、结果可靠、方便经济,可用于PCV2和弓形虫的实验室快速检测。