棉花叶绿体70S核糖体S7蛋白基因的克隆和序列分析

叶绿体基因组具有高度保守性，来源于不同植物的叶绿体基因同源性很高。应用ＰＣＲ技术，从棉花叶绿体基因组扩增并克隆了长度为１．０ｋｂ的叶绿体ＤＮＡ片段。该片段含有叶绿体核本小亚基Ｓ７蛋白基因ｒｐｓ７。采用限制性内切酶消化连接的策略构建亚克隆，并测定了该片段的含部核苷酸序列。结果表明，棉花叶绿体ｒｐａｓ７基因与烟草、不稻的相庆基因同源性高，分别为９７．９％和８９．５％，３非编码区的同源性分别为９６．３％     

植物叶绿体遗传转化及研究进展

叶绿体遗传转化与传统的细胞核遗传转化相比具有许多独特的优点：外源基因表达效率高,可同时转化及表达多个基因,由于通过母性遗传,因此没有基因沉默现象及位置效应,也不会造成外源DNA的扩散。目前已经有超过四十多个外源基因整合到烟草等作物的叶绿体基因组中,表现出理想的农艺性状或作为生物反应器表达高水平的生物疫苗。本文对植物叶绿体基因组转化技术的原理和优点,外源基因导入叶绿体基因组的方法,以及目前叶绿体转化研究的最新进展进行了综述,并对其应用进行了展望。     

CITES监管植物习志野叶绿体基因组结构特征及系统发育分析

利用二代测序技术Illumina平台对CITES附录监管物种习志野(Tephrocactus geometricus)进行叶绿体全基因组测序与组装,并对其基因组结构特征及系统进化关系进行分析。结果表明,习志野叶绿体基因组具备典型的环状四分体结构,全长116 183 bp,包含72个蛋白编码基因、6个rRNA基因和30个tRNA基因。习志野叶绿体基因组共编码16 119个密码子,编码亮氨酸(Leu)的最多;共发现微卫星位点259个,其中最多的是单核苷酸重复序列186个。采用ML法构建系统进化树,习志野与巨人柱属的巨人柱(Carnegiea gigantea)亲缘关系最近。本研究为习志野的分子标记开发、系统发育关系研究、叶绿体转化技术、濒危机制的解析等提供了基础数据参考,同时也丰富了仙人掌科植物的叶绿体基因组遗传信息。     

裸果木叶绿体基因组密码子使用偏性分析

密码子的偏好性由突变、自然选择进化而来,研究叶绿体基因组密码子偏性可进一步明确基因表达效率,对理解物种的系统发育和分子进化具有重要的参考价值。本研究利用Codon W和CUSP软件分析了裸果木植物叶绿体基因组中50个候选基因的密码子使用偏好模式及其形成原因。研究结果显示裸果木叶绿体基因组的密码子碱基组成表现为GC₁>GC₂>GC₃,表明密码子偏爱以A和T结尾;G和C在密码子各位置中的占比较低,平均值为37.98%;有效密码子数(ENC)的平均值为47.55,表明密码子的偏好性较弱;中性绘图、ENC-plot、PR2-plot显示裸果木叶绿体基因组密码子使用偏好主要受突变和自然选择共同影响。另外,联合使用高频密码子和高表达密码子的方法共筛选出裸果木叶绿体基因组中均是由A和U结尾的最优密码子共14个。本研究深入探讨了裸果木叶绿体基因组的最优密码子及成因,可为旱生植物叶绿体基因组的应用与研究提供理论参考。     

檀香科半寄生植物叶绿体基因组比较与进化分析

檀香科植物具有极高的观赏价值与经济价值,其中大多数为半寄生物种,包括兼性半寄生与专性半寄生类型,在半寄生类植物系统发育研究中具有重要的地位。本研究以檀香科12个半寄生物种叶绿体基因组序列为研究对象,分析其基因组基本特征、基因组比较以及系统进化关系。结果表明：(1)基因组特征分析方面：与典型的被子植物叶绿体基因组相比,檀香科半寄生物种叶绿体基因组略有缩短。檀香科物种密码子偏好性与其他陆生植物一致,密码子第三位更偏好A或T。重复序列和SSR序列鉴定结果表明,槲寄生属物种与其他物种在序列数目和长度上存在差异。(2)基因组比较分析发现,部分檀香科植物IR区域扩张引起了LSC-IR边界改变,IR-SSC区域差异是边界处基因区域倒置的结果。此外,部分蛋白编码基因(ndh, infA, matK,rpl33和ccsA)被假基因化或完全缺失。(3)基于叶绿体全基因组序列构建的系统发育树揭示了檀香科物种之间的进化关系,结果显示檀香科半寄生物种叶绿体基因组可能以谱系特异性方式进化。本研究结果为檀香科种间鉴别、SSR分子标记开发、系统发育和叶绿体基因组进化提供了理论基础。     

粗毛淫羊藿叶绿体基因组及其结构分析

本研究通过Illumina HiSeq X-Ten高通量测序平台对粗毛淫羊藿的叶绿体基因组进行测序,并应用生物信息学分析工具对其结构特征进行比较分析。结果表明,粗毛淫羊藿叶绿体基因组大小为156 894 bp,具有被子植物典型的环状四分体结构,大单拷贝区(large single copy, LSC)长度为88 496 bp,小单拷贝区(small single copy, SSC)长度为16 685 bp, 2个反向重复区(inverted repeat sequence, IRa/IRb)长度为25 809 bp;粗毛淫羊藿叶绿体基因组有133个基因,其中包括85个蛋白编码基因、10个rRNA基因和38个tRNA基因,44个外显子,23个内含子。研究结果丰富了淫羊藿属物种的叶绿体基因组资料,可为淫羊藿属物种的分子标记开发、系统学研究与药材的混伪品鉴定提供参考。     

水稻细胞质雄性不育分子生物学研究进展

对水稻细胞质雄性不育与叶绿体基因组、线粒体基因组、质粒基因组和核基因组的遗传以及育性相关基因的分子标记定位、辅助选择、克隆与表达研究现状进行了综述，并对水稻细胞质雄性不育分子机理和分子生物学研究进行了展望。     

金花茶叶绿体基因组密码子偏好性分析

为揭示金花茶叶绿体基因组的密码子偏好性和相关指标变化,探讨适合金花茶叶绿体基因组表达的最佳密码子,本研究利用R语言和Codon W、Microsoft等软件,对金花茶叶绿体基因组中52个编码基因(coding sequence, CDS)的密码子使用模式进行了研究。结果表明,在金花茶叶绿体基因组中,同义密码子的使用偏好以A/U结尾,特别是以U结尾;有效密码子数(effective number of codon, ENC)均大于35,属于弱偏好性;密码子第3位的碱基组成同第1位和第2位存在显著差别,密码子第3位核苷酸的组成对密码子使用偏好性的影响较之其他位点更为重要;除自然选择之外,密码子偏好性还受到突变压力和核苷酸组成等因素的影响;共有16个密码子被鉴定为金花茶叶绿体基因组最优密码子。本研究为金花茶叶绿体基因组的遗传修饰和系统发育研究提供参考。     

南欧大戟叶绿体基因组特征及其系统发育分析

为探究南欧大戟(Euphorbia peplus L.)叶绿体基因组序列特征及系统进化位置关系。本研究以南欧大戟总DNA为研究对象,利用Illumina HiSeq 2500高通量测序仪测定南欧大戟的叶绿体基因组序列,采用GetOrganelle进行完整叶绿体基因组的组装,并借助生物信息学工具进行基因组的注释分析、图谱构建和系统发育分析。结果表明,南欧大戟叶绿体基因组全长159 466 bp,呈典型的四分体环状结构,包括一个大单拷贝区、一个小单拷贝区和两个反向互补重复区,其大小分别为89 398、17 802和26 133 bp,GC值为35.8%;共编码基因130个,其中包括8个rRNA基因、37个tRNA基因和85个蛋白编码基因。基于23种植物系统发育分析结果表明,南欧大戟与同亚科植物浆果乌桕的亲缘关系最近。本研究获取了南欧大戟的叶绿体基因组特征信息和系统发育位置,为该植物的资源开发、品种鉴定和遗传进化研究提供了新的材料基础。     

芜菁叶绿体基因组结构与进化关系分析

本试验以白色芜菁W 21为材料,对其叶绿体基因组进行测序和组装,发现芜菁叶绿体基因组呈153 621 bp的环状双链,共检测到132个基因,CG含量分析显示GC占总碱基数的36.3%,重复结构分析显示共有13种类型的841个重复序列,与6个十字花科蔬菜叶绿体基因组做进化分析比较,显示芜菁叶绿体基因组和白菜亲缘关系更近,芜菁和白菜的叶绿体基因组特征比较进一步发现,ycf1和ndhF基因在叶绿体基因组中比较容易突变。     

用改进的高盐低pH法分离和纯化棉花叶绿体及叶绿体DNA

报道了用改进的高盐低ｐＨ法分离和纯化棉花叶绿体及叶绿体ＤＮＡ的实验过程，即先在高盐（离子强度）介质下，通过ｐＨ值变换，多次洗涤的方法去除叶绿体表面的静电附着杂质，得到纯净的叶绿体；然后氯仿抽提纯化ＤＮＡ；最后采用界面针挑法得到高纯度的ｃｐＤＮＡ。实验过程中针对棉花的特点，采用ＰＶＰ排除棉酚和丹宁的干扰，用ＤＩＥＣＡ抑制酚氧化酶活性，并对实验细节作了较大改进。得到的ＤＮＡ可满足酶切、ＰＣＲ等分子生物学分析。     

雷蒙德氏棉叶绿体基因组Fosmid文库构建

 采用高盐、低pH值法提取雷蒙德氏棉叶绿体DNA;通过物理剪切法获得随机断裂的DNA片段;剪切片段末端、补平修饰后与pCC1FOS载体连接;用噬菌体包装蛋白包装重组DNA,侵染大肠杆菌EPI300,构建了雷蒙德氏棉叶绿体基因组文库。对于叶绿体DNA剪切,以1 mL注射器中等速度吸打18次为最佳参数。叶绿体基因组Fosmid文库滴度为1×10⁴ cfu·mL^-1,插入片段大小平均为38 kb,最终筛选出39个克隆用于后续研究,覆盖叶绿体基因组9.2倍。以叶绿体特异标记筛选出能够覆盖雷蒙德氏棉叶绿体全基因组的6个克隆：F66,F46,F28,F8,F55和F3,为基因组结构和功能基因分析提供了良好的基础。     

北疆灌耕灰漠土施钾对棉花钾素营养生理和产量的影响

 选择新疆北疆棉区具有代表性的灌耕灰漠土,采用透射电镜显微技术和常规分析方法,对棉花的钾素营养和钾肥肥效进行了研究。结果表明,施钾可提高棉花冠层功能叶的气孔导度,改善棉花生长中后期功能叶的叶绿体超微结构,使基粒片层数量多且排列整齐致密,而不施钾会导致棉花功能叶片叶绿体过早解体。施钾显著提高了棉花的含钾量,叶和铃壳中钾含量比对照分别增加了13.3%和6.3%。施钾可使果枝数增加11.8%,显著提高皮棉产量,但对纤维品质无明显作用。     

番茄质体多顺反子定点整合表达载体的构建及其转烟草的研究

根据烟草叶绿体高频同源重组片段的已知序列(GenBank Z00044.1)设计引物,用PCR的方法克隆到1个3.663 kb的番茄叶绿体DNA片段（psbD/trnG）,命名为ctDNA。该片段与GenBank中烟草的相应片段有96.7%同源性, 与本文所用的烟草的相应片段有95.8%同源性。以其为外源多顺反子定点整合介导的同源重组片段,与来自烟草叶绿体的强启动子Prrn和终止子psbA3’,以及甘露聚糖酶基因man、绿荧光蛋白基因gfp、氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶基因aadA构建番茄质体多顺反子定点整合表达载体pLM2(-psbD-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3’-trnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草3株。用PCR、激光扫描、Western Blot、RFLP等方法检测都证实man、gfp、aadA基因已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达。用番茄质体多顺反子定点整合表达载体成功实现在烟草质体中的表达。     

棉花单核苷酸多态性标记研究进展

单核苷酸多态性标记已在农作物研究中得到广泛应用并取得重大进展。为了便利棉花SNP(Single nucleotide polymorphism)标记的研究和应用,介绍了利用基因芯片、简化基因组测序、重测序等在棉花中开发SNP标记的方法 ,综述了SNP标记在棉花遗传图谱构建、数量位点的定位和分子标记辅助育种、基因组测序以及系统进化等研究中的应用。并对异源四倍体棉花中SNP标记开发时,同源序列位点和部分同源序列位点上的SNP标记辨别问题进行了系统探讨,对其快捷的开发、检测方式和在数量基因定位中的应用前景进行了展望。     

转Bt基因棉Bt蛋白的亚细胞结构定位

为了探明Bt棉晶体蛋白在细胞中定位的特异性,揭示Bt棉抗虫稳定性,以转Bt基因棉GK-12为试材,采用免疫细胞定位的方法,在亚细胞结构水平上研究Bt蛋白的定位取向。结果表明,Bt蛋白主要分布在细胞质和细胞壁间隙中,并且,在细胞质中的分布密度高于细胞壁间隙;在细胞质中,晶体蛋白主要分布在细胞膜、内质网、叶绿体和前质体上,并且在叶绿体和前质体上面高密度集中分布。说明转Bt基因棉GK-12叶肉细胞中,外源晶体毒蛋白的定位取向于惰性细胞器—叶绿体及其前体。     

Physical mapping of differences between the chloroplast DNAs of Beta vulgaris and B. webbiana

A physical map of Beta webbiana (a wild species of the section Pro-cumbentes) chloroplast genome was constructed by localizing the cleavage sites of SmaI, PstI, PvuII, XhoI, and HindIII, and the map was then aligned with the map of sugarbeet (B. vulgaris) chloroplast DNA. This alignment shows 27 restriction-site changes and 11 insertions/deletions, most of which occur in the large single-copy region of the genome. A 0.7-kb long mutation, located within an unidentified open reading frame (ORF2280) in the inverted repeat, was also found.     

水稻巯基蛋白酶抑制剂基因在烟草叶绿体中的表达

将水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC) cDNA基因克隆、测序分析后,与烟草(Nicotiana tabacum L.)叶绿体16S rDNA基因启动子和T393终止子构建表达盒,与抗壮观霉素选择标记基因aadA表达盒相连,以烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和ORF512一起构建成叶绿体转化载体pZOC.通过基因枪轰击烟草幼苗叶片,壮观霉素筛选,获得转化再生     

麻疯树叶绿体?-3脂肪酸去饱和酶的BIBAC文库筛选及其生物信息学分析

旨在建立麻疯树BIBAC文库筛选目的基因快捷高效的方法,并对其克隆的叶绿体?-3脂肪酸去饱和酶基因进行生物信息学分析。本研究利用高密度杂交膜从麻疯树BIBAC文库中筛选到含有叶绿体?-3脂肪酸去饱和酶基因的克隆,对其测序并用生物信息软件对获得全长序列及编码的蛋白质序列的特性进行分析。将筛选到的阳性克隆进行测序,并将该序列与麻疯树叶绿体?-3脂肪酸去饱和酶基因进行比对,相似性达到99%,证实此克隆为含叶绿体?-3脂肪酸去饱和酶基因(JcFAD7)的BIBAC克隆。麻疯树叶绿体?-3脂肪酸去饱和酶基因长度为2655 bp,含有8个外显子和7个内含子,编码525个氨基酸。该基因编码的蛋白质为不具有信号肽的亲水性蛋白,二级结构元件多为α-螺旋和无规则卷曲,含有2个大的跨膜区域,在麻疯树中为单拷贝。本研究建立了高密度杂交膜从BIBAC文库中筛选目的基因快速高效的方法,同时也验证了该方法的可行性并对克隆到的基因进行了生物信息学分析。