黄曲霉毒素B1标准替代物的制备及其在花生样品检测中的应用

以抗黄曲霉毒素B1（AFB1）单克隆抗体的F(ab’)2 片断为抗原免疫兔子,得到AFB1抗独特型抗体。经过酶联免疫吸附法（ELISA）条件的优化,建立AFB1抗独特型抗体最佳竞争抑制曲线。该曲线与AFB1竞争抑制曲线相比较可知,AFB1抗独特型抗体与AFB1之间存在指数增长关系,且相关性系数R为0.999 8。以AFB1抗独特型抗体浓度与其相应的抑制率作标准曲线,ELISA法测定花生中AFB1添加回收率,范围在90.4%~100.2%之间。综上,AFB1抗独特型抗体可以作为AFB1无毒替代标准品,为黄曲霉毒素检测无毒化提供了广阔的应用前景。     

氯化钙对花生中黄曲霉毒素B1提取及其快速检测结果的影响

本文以氯化钙为蛋白沉淀剂、黄曲霉毒素B1为靶标,探究了70%甲醇水（V/V）提取液中不同含量氯化钙对花生中黄曲霉毒素提取及其免疫检测结果的影响;采用样品加标回收的方法,研究比较了五种不同含量氯化钙对胶体金免疫层析试纸条和ELISA检测结果的影响。研究结果表明,样品经含1% CaCl2 （m/V）的甲醇水处理后,用胶体金免疫层析试纸条检测时,试纸条T线颜色梯度变化,不同浓度加标回收率等参数均得到明显改善,前处理效果显著;选取20份花生实际样品,经过这种前处理之后,进行胶体金免疫层析试纸条和ELISA检测,同时将其检测结果与免疫亲和层析高效液相色谱法（IAC-HPLC）进行比对,胶体金免疫层析试纸条与IAC-HPLC检测结果符合率为90%,间接竞争ELISA与IAC-HPLC检测结果相关性系数达0.996,表明本研究所改进的样品前处理方法能提高免疫检测准确度,具有很好的应用性。     

量子点标记荧光免疫法检测花生中黄曲霉毒素B1

建立了基于量子点标记二抗的间接竞争荧光免疫吸附测定方法（indirect competitive fluorescence-linked immunosorbent assay,cFLISA）,并研究检测花生中黄曲霉毒素B1可行性。采用谷胱甘肽为稳定剂,在水相中直接合成碲化镉（CdTe）量子点,并利用EDC与兔抗鼠二抗进行共价偶联,以黄曲霉毒素B1的单克隆抗体建立cFLISA方法。结果表明,该方法的灵敏度和最低检测限值分别为0.023ng/mL和0.001ng/mL,与传统的有机染料FITC-二抗法比较,灵敏度提高了30倍,花生样品加标0.1、0.05和0.025ng/g,回收率范围在88%~116%之间,变异系数均小于10%。建立的cFLISA方法可以较好的检测花生中黄曲霉毒素B1,并为其它真菌毒素的检测提供参考。     

粮油产品黄曲霉毒素B1检测技术研究进展

对黄曲霉毒素检测技术进行了简要介绍和评述,并对近年来粮油及制品黄曲霉毒素B1快速检测方法研究进展和发展趋势进行了综述和讨论.     

高特异性黄曲霉毒素B1单克隆抗体的 制备及特性研究

本研究将黄曲霉毒素B1转化为其半缩醛B2a,在硼氢化钠（NaBH4）还原作用下与载体蛋白偶联制备完全抗原。将制备的完全抗原免疫Balb/c小鼠,经4次免疫后取其脾脏与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0细胞融合,采用半固体培养基筛选后鉴定,获得杂交瘤细胞株3A12,抗体的灵敏度可达6.1±0.025ng/mL,抗体与其它黄曲霉毒素B2、G1及G2的交叉反应率依次为7.8%、20.2%及0.6%,与黄曲霉毒素M1交叉反应率小于0.1%。为研发花生等农产品黄曲霉毒素B1特异性免疫分析技术及产品奠定了重要基础。     

抗黄曲霉毒素B1单链抗体(scFv)库的建立和筛选

从抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体细胞系中扩增到重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),经PCR将VH、Linker和VL连接成单链抗体(scFv),并克隆到载体pCANTAB-5E,经电转化大肠杆菌TG1,构建了库容量为1×108的单链抗体库.通过辅助噬菌体M13K07感染后,使单链抗体展示在噬菌体衣壳蛋白pⅢ的N端,得到客容量为1×108的噬菌体展示的抗体库.将抗体库用于"淘洗-富集-扩增"4轮以后,得到针对AFB1特异性的噬菌体抗体.进一步以噬菌体感染大肠杆菌HB2151,在细菌细胞周质中可溶性大量表达,最终经竞争EUSA分析表明获得了3株可以稳定分泌抗黄曲霉毒素B1 scFv菌株,分别命名为3C3、383和4A2.     

花生及其制品中黄曲霉毒素B1 免疫亲和柱净化—荧光快速检测技术研究

报道了一种免疫亲和柱净化-荧光法快速检测花生及其制品中黄曲霉毒素B1的分析方法。用70%甲醇对样品进行初步提取，过滤后用石油醚萃取脱脂，萃取液稀释后用免疫亲和微柱纯化富集，洗脱液放入黄曲霉毒素专用荧光定量速测仪器中自动读取结果。该方法直接读数的线性范围为0.3~25µg/kg，R2=0.9995，方法的平均回收率超过90%，变异系数低于5%，最低定量浓度为0.3µg/kg。应用于花生及其制品的黄曲霉毒素B1检测，单个样品检测全过程（含样品提取）所需时间可以控制在45min左右，检测成本低于其他仪器方法。     

粮油黄曲霉毒素B1 高效快速检测微柱的研制

研制并比较了7种不同类型的黄曲霉毒素B1 纯化微柱,优选出AFTB1 - Ⅰ亲和微柱,具有分离高效、操 作简便适于快速检测的特点。设计出与微柱净化配套使用的半自动化负压装置,可简化净化操作步骤、缩短操作 时间。对亲和微柱的进样条件、淋洗条件、洗脱条件、流速、结合容量、加标回收率、稳定性等进行了研究,结果表 明:微柱的结合容量> 25μg/kg,不同水平加标回收率范围为80. 00% ～91. 50%。不同批次微柱的加标回收率相对 标准偏差为1. 76% ,无显著差异。同时,采用现有国标方法,利用本实验研制的亲和微柱对实际样品净化,不同水 平加标回收率范围为80. 00%～92. 00% ,能满足国标检测限量范围内粮油中黄曲霉毒素B1 的快速检测要求。     

黄曲霉毒素B1检测中的应用

 采用黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条及配套的时间分辨荧光速测仪,对油料饼粕中黄曲霉毒素B1的快速检测进行了应用研究。该时间分辨荧光免疫分析技术是基于时间分辨荧光免疫层析试纸条和载有Eu(Ⅲ)标记特异性单克隆抗体的样品瓶建立的检测技术。时间分辨荧光速测仪可内置标准曲线,直接输出检测结果。对6种油料饼粕做黄曲霉毒素B1添加回收率实验,回收率在70%～120%之间,批间、批内变异系数＜15%。在实际样品的检测中,时间分辨荧光免疫层析试纸条检测技术与液相色谱-串联质谱法相比,检测结果相对误差＜15%。时间分辨荧光免疫层析试纸条检测技术测定快速、准确,技术稳定、可靠,设备经济、小型,适用于大批量油料饼粕样品的快速检测和风险评估,具有广阔的应用前景。     

聚丙烯酰胺固相微球与黄曲霉毒素B1抗体偶联条件的研究

以表面带羧基的聚丙烯酰胺固相微球为载体,通过碳二亚胺(EDC)活化,共价结合兔黄曲霉毒素B1抗体.研究结果表明最适偶联pH值为6.0～6.5,最适反应时间为17～20h,最佳EDC用量为5～15mg/10mg微球.抗体的最大偶联效率达60.40%,为利用聚丙烯酰胺微球建立黄曲霉毒素快速检测技术奠定了基础.     

Effect of non-aflatoxigenic strains of Aspergillus flavus on aflatoxin contamination of pre-harvest peanuts in fields in China

Aflatoxin contamination of peanuts is one of the most concerns in peanut production in China. Applying non-aflatoxigenic Aspergillus flavus strains, based on competitive exclusion, has been proved to be a promising strategy to reduce aflatoxin contamination in pre-harvest peanuts. Two non-aflatoxigenic A. flavus strains collected in China, which have been proved effectively reducing aflatoxin in the laboratory, were mixed with high aflatoxin producer to the soil in peanut growing season. The two non-aflatoxigenic strains significantly (P ​< ​0.05) reduced aflatoxin contamination in peanut kernels under both normal and drought stresses in two fields. Compared to control, the total aflatoxin (sum of aflatoxin B₁ and B₂) was reduced 26.7–99.12% in field 1, and 84.96–99.33% in field 2. The aflatoxin was reduced 84.96–99.33% under drought stress in two fields. The present study indicated the non-aflatoxigenic A. flavus strains could be potential biocontrol agents for reducing aflatoxin contamination under field condition.     

黄曲霉毒素限量标准对我国居民消费安全和花生产业的影响

2009-2010年对全国花生黄曲霉毒素污染进行了普查监测,根据检测结果,利用蒙特卡罗方法,开展了我国与CAC、欧盟、日本、澳大利亚和新西兰等国际组织和主要贸易国不同花生黄曲霉毒素限量对我国人群直接食用花生的致癌风险和对产业影响的研究。结果表明,不同花生黄曲霉毒素限量标准对我国人群摄入产后花生导致的原发性肝细胞癌年发生率影响差异不显著,但对经济和产业造成的影响差异显著。研究结果为制定我国花生黄曲霉毒素限量标准以及促进花生生产、贸易提供技术参考。     

胶体金免疫层析法快速定量分析粮油农产品中黄曲霉毒素B1

采用自主研制的黄曲霉毒素B1胶体金免疫定量检测卡,建立花生、玉米、大米、小麦等粮油农产品中黄曲霉毒素B1的定量分析方法,4种样品检测的线性范围为1.0～20.0μg/kg,R2＞0.97,方法的定量限为1.0 μg/kg,样品加标回收率为75%～106%,RSD＜20%。胶体金免疫层析法与免疫亲和柱净化-HPLC法相比,相对误差＜15%,具有简便快速、灵敏度高、重现性好等特点,适用于粮油农产品及制品中黄曲霉毒素B1 筛查,样品检测时间只需15min,检测成本低于其他方法。     

Comparison of penicillinase-based and alkaline phosphatase-based enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of six potato viruses

Summary A penicillinase (PNC)-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was compared with one based on alkaline phosphatase (ALP) to detect potato viruses A, S, V, X and Y, and potato leafroll virus. Tests were made with different ratios (w/w) of γ-globulin∶enzyme in the conjugation reaction. The γ-globulin fraction of antisera to the viruses was conjugated to ALP or to PNC by the single step glutaraldehyde bridge method using the ratio of 1∶1 (γ-globulin∶enzyme). The ALP conjugates worked well but PNC conjugates gave substantial non-specific reactions and in general were not suitable for ELISA. However, PNC conjgates made with a ratio of 1∶0.05 (γ-globulin∶enzyme) gave little or no non-specific reaction and were at least as sensitive as ALP conjugates. Both ALP and PNC conjugates were found to be useful in three variants of ELISA (double antibody sandwich; plate-trapped antigen and a simplified plate-trapped antigen form of ELISA) to detect the six potato viruses. Although PNC-based ELISA often required longer incubation with substrate to achieve the same sensitivity of detection as with ALP-based ELISA, this is only a minor disadvantage and PNC should prove to be more economical and safer to use than ALP.