梅花鹿卵巢颗粒细胞的体外培养与鉴定

卵巢颗粒细胞在卵母细胞生长和卵泡发育过程中起着重要作用,为卵母细胞提供营养,分泌孕酮和雌二醇,与膜细胞一起调控卵泡的增殖和分化。卵巢颗粒细胞也具有干细胞特性,可以作为核移植的替代物,用卵泡刺激素受体(FSHR)抗体能很快地鉴定颗粒细胞。本研究通过对梅花鹿卵巢颗粒细胞进行体外培养,旨在探索梅花鹿颗粒细胞长期体外培养的条件,描述颗粒细胞的形态和表型特征,为进一步研究颗粒细胞的功能奠定基础。试验结果表明,梅花鹿卵巢颗粒细胞呈多角形或梭形,并伸出伪足,呈放射状生长,FSHR抗体鉴定结果为颗粒细胞纯度>90%。用含15%胎牛血清和1%双抗的DMEM/F12培养液培养,可获得生长活性好、细胞纯度高的梅花鹿卵巢颗粒细胞,HE染色和FSHR免疫荧光染色可以简便快速地鉴定梅花鹿卵巢颗粒细胞。     

小鼠卵巢颗粒细胞的优化培养

为了找到小鼠卵巢颗粒细胞更加合适的体外生长环境,本研究分别向分离的小鼠卵巢颗粒细胞中加入无血清RMPI1640、含10%血清RMPI1640、无血清DMEM（高糖）、含10%血清DMEM（高糖）及含15%血清DMEM（高糖）的培养液对小鼠卵巢颗粒细胞进行体外培养。试验经观察结果显示,DMEM（高糖）总体培养效果好于RMPI1640,且含15%血清的DMEM（高糖）是较理想的培养用液。     

水牛卵巢颗粒细胞的分离培养及凋亡测定

研究主要是通过比较水牛卵巢颗粒细胞在不同培养基中的生长状态,并对细胞的增殖、核型及凋亡情况进行检测,以了解水牛卵巢颗粒细胞体外生长特性,建立水牛卵巢颗粒细胞的体外培养体系。结果发现,分离获得的水牛卵巢颗粒细胞存活率约为60%;采用DMEM培养基,颗粒细胞的生长速度和生长状态优于TCM-199和DMEM/F12培养基;细胞培养24 h后开始零星增殖,3~5 d增殖速度达到高峰;第1、3、5、7代颗粒细胞正常核型比率差异不显著,均在85%以上;第1代颗粒细胞的凋亡率与第5代差异显著(P<0.05),与第7代差异极显著(P<0.01)。结果表明,DMEM培养基更适宜用于水牛颗粒细胞的体外培养;水牛颗粒细胞能稳定地进行传代培养,染色体的数目不会发生明显改变,但细胞凋亡率会随着培养代数的增加而明显升高。     

西藏牦牛颗粒细胞的体外培养

分别收集西藏牦牛卵泡液中和卵母细胞成熟培养后分离下来的颗粒细胞,进行体外培养实验,以优化西藏牦牛颗粒细胞的体外培养方法。实验结果显示:原代培养时,从卵泡液中收集的颗粒细胞和从卵母细胞成熟培养后分离下来的颗粒细胞形成单层分别需要6~7 d和5~6 d;传代培养时,2种来源的颗粒细胞均在接种后第2天开始贴壁,第3~5天呈优势生长,第6天左右长满平皿底,当传至第3代培养后,即可获得纯化的颗粒细胞。实验结果表明,与从卵泡液中分离下来的颗粒细胞相比,收集从卵母细胞成熟培养后分离下来的颗粒细胞进行体外培养具有简便、快速的优点。     

猪卵巢颗粒细胞分离培养及鉴定

为构建猪卵巢颗粒细胞的体外培养体系,研究毒素的生殖毒性奠定基础,采用机械分离法从1～5 mm的卵泡中提取猪卵巢颗粒细胞,苔盼蓝染色计算细胞存活率,Giemsa染色和结晶紫染色观察细胞形态,免疫细胞化学染色方法检测促卵泡刺激素受体(FSHR)表达来鉴定颗粒细胞,MTT方法测定细胞生长曲线.结果显示分离提取的猪卵巢颗粒细胞存活率为65%左右,细胞纯度＞97%,细胞结构完整,边缘分明,胞核呈卵圆形位于靠近胞质的中央.另外细胞生长曲线表明,细胞从24 h开始进入对数生长期,并于96 h达到最高密度,之后进入平台期.分离培养的颗粒细胞生长状态良好,且细胞纯度＞97%,是理想的适合进行毒素生殖毒理学的细胞培养体系.     

玉米赤霉烯酮对体外培养猪卵巢颗粒细胞的影响

以原代培养的猪卵巢颗粒细胞为模型,设立玉米赤霉烯酮(ZEA)对照组(0.0 mg/L)及高(80.0 mg/L)、中(20.0,40.0mg/L)、低(0.2,2.0mg/L)剂量组,比较不同质量浓度ZEA对体外培养猪卵巢颗粒细胞的影响。形态学观察发现,随着ZEA质量浓度的增加,颗粒细胞呈散在生长,体积缩小变圆,数量减少;高剂量组(80.0mg/L)中,76.96%细胞均已脱壁死亡。MTT法表明,ZEA对卵巢颗粒细胞具有生长抑制作用;免疫荧光结果显示随ZEA质量浓度的增加,细胞凋亡率逐渐升高,高质量浓度组细胞增殖率仅为1.01%;Western blot检测结果显示经ZEA处理,Fas、FasL、FADD、Caspase-10的表达量均明显上调,且存在质量浓度-效应关系。结果表明,ZEA能诱导卵巢颗粒细胞凋亡,并显著上调Fas、FasL、FADD、Caspase-10的表达,可通过死亡受体通路介导卵巢颗粒细胞发生凋亡。     

家禽卵泡颗粒细胞体外培养方法研究进展

家禽卵巢中颗粒细胞在卵泡发育和闭锁中起着重要作用,包括信号传递、营养供给以及离子平衡等。卵泡颗粒细胞的增殖与分化自身也受到生殖激素和细胞因子的综合调节,其作用机制是当前研究热点。家禽卵泡颗粒细胞的体外培养可作为研究繁殖生理调节的理想细胞模型。本文对家禽卵泡颗粒细胞的体外培养研究现状及颗粒细胞在卵泡生长发育和闭锁中的作用进行简要概述,并总结了原代颗粒细胞体外培养模型的建立方法。     

绵羊卵泡颗粒细胞的体外培养与保存

哺乳动物卵巢内含有数量庞大的腔前卵泡,然而在生理条件下,这些卵泡只有大约1%能发育到成熟的排卵阶段,其余都由于闭锁而退化,这是对雌性繁殖潜力的极大浪费。通过在体外培养复苏这些卵泡的生长,可以为体外受精,克隆和转基因等生物工程技术提供潜在的同种质卵母细胞来源[1]。特别是随着克隆和转基因技术的发展,将来对卵母细胞的需要越来越大,只靠回收窦腔卵泡中的卵子已经不能满足需求,通过体外培养卵巢组织或者卵泡,复苏卵巢中占主导地位的腔前卵泡的生长,可以加强我们对卵泡颗粒细胞生存、发育的生理调节机制的了解,对于提高高遗传和经济价值的家畜以及在科研上具有重要价值的动物的繁殖潜力,珍稀或濒危动物的保护以及人类生育能力的保存和辅助受孕具有重大意义[2]。     

哺乳动物卵泡颗粒细胞体外培养研究概况

卵泡颗粒细胞在卵泡的发育过程中起着重要作用,在卵泡颗粒细胞的增殖分化同时又受到多种生殖激素和细胞因子的调节。卵泡颗粒细胞作为研究动物生殖生理的一种理想的细胞模型,作者对哺乳动物卵泡颗粒细胞的体外培养及其在动物生殖生理中的作用作一简要概述。     

α-亚麻酸对水牛卵巢颗粒细胞体外培养的影响

【目的】研究α-亚麻酸(ALA)对水牛卵巢颗粒细胞体外培养过程中细胞活力、细胞凋亡、细胞周期相关基因表达及激素分泌功能的影响。【方法】为了筛选体外培养水牛卵巢颗粒细胞ALA最适浓度,在96孔板中加入起始细胞数量为1×10⁴/mL的水牛卵巢颗粒细胞,细胞贴壁12 h后更换含0(对照组)、10、50、100、200μmol/L ALA的培养液,在相同条件下处理24 h,用CCK-8进行细胞活力检测,筛选出最适处理浓度,并用于后续试验。后续试验分为对照组(0μmol/L)和处理组(50μmol/L)两组,用实时荧光定量PCR检测颗粒细胞中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白1(p21)和增殖细胞核抗原(PCNA)基因的相对表达量,用免疫荧光对颗粒细胞中细胞凋亡相关蛋白Caspase-3和细胞周期相关蛋白p21进行荧光检测和定量分析,用ELISA法检测培养液中水牛颗粒细胞分泌的雌二醇(E₂)和孕酮(P₄)含量。【结果】与对照组相比,水牛卵巢颗粒细胞经ALA处理2...     

小鼠 鸡卵巢颗粒细胞分离 培养方法的比较与优化

本试验通过分离与培养小鼠、鸡不同等级卵泡颗粒细胞,比较其培养和形态差异,并对提取方法进行优化。试验选取3周龄雌性昆明系小鼠,200日龄的海蓝褐蛋鸡,分别采用优化的方法分离培养卵巢颗粒细胞,通过观察细胞形态、H.E.染色和间接免疫荧光,对比不同种属颗粒细胞提取方法、培养条件及生长状态。结果表明,与采用机械法分离的小鼠卵巢颗粒细胞相比,采用酶消化法分离的鸡不同等级卵泡颗粒细胞贴壁较快、生长速度快、伪足较多。分析得出小鼠与鸡不同等级卵泡颗粒细胞的分离,培养条件均有差异,且对已有提取方法进行优化,所培养的颗粒细胞状态良好。     

miR-1307在猪卵巢颗粒细胞周期中的作用

为了解猪miR-1307序列和结构特征,阐明其在猪卵巢颗粒细胞周期中的作用,利用生物信息学方法分析猪miR-1307的序列特征、染色体定位和潜在的生物学功能;在体外培养的猪卵巢颗粒细胞中转染miR-1307模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor),利用流式细胞术检测细胞周期。结果显示:猪miR-1307前体序列长度为80 bp,其核苷酸序列(包括成熟序列和种子序列)和基因组定位等与哺乳动物其他物种高度一致;功能富集分析发现miR-1307靶基因富集在rRNA分解代谢进程和蛋白酪氨酸磷酸酶活性等多个重要的生物学进程和分子功能中;在猪卵巢颗粒细胞中,过表达miR-1307可使G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例显著降低(P<0.05);抑制miR-1307可使G0/G1期细胞比例降低,S期细胞比例显著增加(P<0.05)。结果表明:miR-1307是猪卵巢颗粒细胞周期的重要调节因子。     

体外培养牛腔前卵泡颗粒细胞的超微结构研究

透射电镜下，简易机械法分离得到的腔前卵泡有1～3层颗粒细胞，相邻颗粒细胞间存在明显而广泛的间隙连接，卵泡基膜完整，外无卵泡膜。培养过程中超微结构的变化与体内发育腔前卵泡类似。培养6d时观察到颗粒细胞增殖现象，培养15d时，个别卵泡的内膜细胞开始形成。超微结构研究结果表明，本培养体系适于小腔前卵泡的体外培养。     

卵泡FSH受体mRNA的表达及其对卵母细胞体外培养成熟率的影响

本研究采用RT-PCR技术检测了猪大、中、小卵泡颗粒细胞中FSH受体(FSHR)mRNA的表达差异,比较和分析了受体表达差异及其对卵母细胞体外成熟培养的影响。结果表明大、中、小卵泡中颗粒细胞都有FSHR mRNA表达,大卵泡的颗粒细胞与小、中卵泡的颗粒细胞FSHR mRNA相对表达量有显著差异(P<0.05),中、小卵泡的颗粒细胞FSHR mRNA相对表达量之间无显著差异(P>0.05)。不同大小卵泡卵母细胞体外成熟培养结果表明,小卵泡与大、中卵泡比较,卵丘细胞扩展率和第一极体排出率差异显著(P<0.05)。这表明猪不同大小卵泡颗粒细胞FSHR mRNA的表达量与其卵母细胞体外培养成熟率呈相关性,进一步证实FSHR在猪卵泡及卵母细胞发育中起着重要作用。     

猪原代肝细胞的分离及体外培养模型的建立

采用剪切消化法 ,对猪肝细胞进行了分离和原代培养。结果显示 :分离的肝细胞即时存活率为 93.4 % ,培养存活率为 87.6 % ,并观测了肝细胞体外的生长形态和增殖规律 ,摸索了建立猪原代肝细胞体外培养模型的条件 ,为在细胞水平研究猪的营养代谢提供了方法和技术保障     

牛卵泡颗粒细胞无血清培养的形态学观察

以McCoy＇s 5a为基础培养液添加硒、转铁蛋白、雄烯二酮、谷氨酰胺，对牛卵巢上大（直径＞8mm）、中（4mm＜直径＜8mm）、小（直径＜4mm）非闭销卵泡的颗粒细胞进行无血清培养。结果表明，McCoy＇s 5a无血清培养中的颗粒细胞形态与分化特点类似于体内情况，说明颗粒细胞在该培养条件下，其功能可能更接近体内的生理状况。     

猪骨骼肌细胞的体外培养初探

1 材料与方法 1.1 试验材料 1、15、21日龄的仔猪;DMEM和标准胎牛血清,由美国Hyclone公司提供,抗生素,包括青霉素、链霉素.     

猪卵巢颗粒细胞和黄体细胞凋亡的调控机制研究进展

母猪卵巢皮质上存在大量卵泡,卵泡由原始卵泡向初级卵泡、次级卵泡逐步发育为排卵前的成熟卵泡时,伴随着卵泡闭锁的发生。目前认为颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的主要因素,并且已经证实。卵泡成熟后会破裂排卵,如果卵子未受精,则黄体会发生萎缩并退化,形成称作白体的结缔组织,最终被组织吸收。细胞凋亡受到多基因严格控制,随着分子生物学技术的发展,已经证明存在多个信号通路。本文以猪卵巢为模型,综述了卵泡闭锁期间颗粒细胞凋亡和黄体退化过程中黄体细胞凋亡的调控机制,以期为深入研究卵巢细胞凋亡提供理论基础。     

牦牛输卵管上皮细胞和卵泡颗粒细胞的培养

分离培养牦牛输卵管上皮细胞和卵泡颗粒细胞的目的是克服体外受精中早期胚胎发育阻断,建立有利于牦牛早期胚胎体外发育的共培养体系.采集牦牛输卵管上皮细胞进行原代及传代培养,同时从卵泡液中获取颗粒细胞进行原代培养,培养过程中观察2种细胞的生长方式和形态特点.输卵管上皮细胞贴壁生长时,呈多边形,且呈单层成簇生长.培养144 h～216 h,可形成细胞单层.颗粒细胞贴壁生长时,呈现聚集生长特性,贴壁细胞形状不规则,呈放射状.培养72 h～96 h,形成颗粒细胞单层.     

牦牛输卵管上皮细胞和卵泡颗粒细胞的培养

从牦牛输卵管壶腹部获取上皮细胞,用抽吸法从牦牛卵泡中获取颗粒细胞,对牦牛输卵管上皮细胞和卵泡颗粒细胞进行体外培养和传代的培养,观察培养过程中2种细胞原代和传代培养的生长方式及形态特点。两者培养144~216 h可形成融合的单层细胞,其传代密度保持105~106/mL为宜。