应用间接荧光抗体法检测鱼类嗜水气单胞菌的试验研究

作者制备了鱼类嗜水气单胞菌（AH）－77株兔抗血清,建立了应用间接荧光抗体试验（IFA）检测鱼类嗜水气单胞菌病原的方法。该法能有效地检测人工感染鳟鱼体内的嗜水气单胞菌病原体,对杀鲑气单胞菌、荧光假单胞菌、爱德华氏菌不发生交叉反应。整个过程可在2．5h内完成,是一种有前途的鱼类嗜水气单胞菌快速诊断方法。     

ELISA和微量凝集法检测马流产沙门菌血清抗体的比较

为比较微量凝集(MSAT)和间接ELISA方法检测马流产沙门菌血清抗体的检出率和符合率,本试验分别用全菌包被间接ELISA、MSAT法对采集的191份马血清及标准阴阳性血清进行马流产沙门菌抗体的检测,并对两种方法进行比较分析。MSAT法和间接ELISA法的阳性检出率分别为45.03%和47.12%,MSAT法与间接ELISA法的符合率为89%。MSAT法不需要精密的仪器,便于操作,操作周期短,但存在观察时的人为误差;间接ELISA具有较高的敏感性、特异性和准确性。在实践中可以将两种方法相结合使用。     

隐孢子虫P23基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

将隐孢子虫鼠基因型（Cryptosporidium mouse genotype）P23基因亚克隆到pGEX-4T-1载体中,并用大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌诱导表达。以纯化的rP23为诊断抗原,建立隐孢子虫间接ELISA检测方法,观察其敏感性、特异性和重复性,并对临床血清样品进行检测。结果隐孢子虫鼠基因型P23基因在大肠杆菌中获得了高效表达,Western blot检测显示rP23能被隐孢子虫感染兔血清识别。以纯化rP23为诊断抗原,成功地建立了检测兔隐孢子虫病的间接ELISA技术。对23份临床血清检测结果显示,该方法检出率高于Sheather＇s蔗糖漂浮法、套式PCR法。本研究结果为研制兔隐孢子虫病诊断试剂盒打下了基础。     

如何把握间接血凝技术中的重要环节

间接血凝技术是本世纪40年代建立的一种血清学方法。它的原理是通过直接吸附或化学偶联的方法把抗原或抗体结合到动物的红细胞上,当其遇到相应的抗体或抗原时,即发生肉眼可见的红细胞凝集现象。把抗原联结到红细胞上检测抗体称之为正向间接血凝;把抗体联结到红细胞上检测抗原称为反向间接血凝。该法以其试剂制备简单、成本低廉、准确、快速、灵敏及操作简便等优点,在人医和兽医临床诊断和流行病学研究上得到广泛应用。     

同时检测水禽3种常见病原菌的环介导间接PCR方法的建立

为建立同时检测大肠杆菌、禽源多杀性巴氏杆菌和鸭疫里默氏菌等水禽常见病原菌的环介导间接PCR方法,根据大肠杆菌的gapA基因、禽源多杀性巴氏杆菌的KMT1基因、鸭疫里默氏菌的OmpA基因序列,分别设计引物、标记于猪线粒体基因片段的两端,制备不同细菌的捕获探针;将捕获探针与待检测菌的基因组杂交、补平缺口、环化。采用1对引物反向扩增捕获探针,建立检测水禽3种常见病原菌的环介导间接PCR方法,扩增片段大小分别为328,422和504bp。沙门菌、金黄色葡萄球菌、小鹅瘟病毒的检测结果为阴性。该方法能检测出100pg的细菌基因组DNA,与常规PCR的符合性为100%。该方法可用于水禽3种常见病原菌的同时检测,是一种特异性好、灵敏度高的快速病原学诊断方法。     

副猪嗜血杆菌抗体间接血凝试验

副猪嗜血杆菌病的诊断是当前研究的热点和难点之一。本试验的目的是为建立间接血凝试验诊断HPS的方法，为检测该病提供依据。结果表明，间接血凝法在检测HPS抗体方面有较高的特异性和敏感性，具有操作简单、耗时少，直接测出抗体效价的高低，不需要复杂的仪器设备和熟练的技术人员等优点，具有良好的推广和应用价值。     

副猪嗜血杆菌抗体间接血凝试验

副猪嗜血杆菌病的诊断是当前研究的热点和难点之一.本试验的目的是为建立间接血凝试验诊断HPS的方法,为检测该病提供依据.结果表明,间接血凝法在检测HPS抗体方面有较高的特异性和敏感性,具有操作简单、耗时少,直接测出抗体效价的高低,不需要复杂的仪器设备和熟练的技术人员等优点,具有良好的推广和应用价值.     

鸭疫里默菌实验室诊断方法研究进展

鸭疫里默菌病是危害养鸭业的重大疾病之一,在临床初步诊断的基础上,实验室诊断必不可少。目前已报道的鸭疫里默菌实验室诊断方法主要有细菌的分离鉴定、琼脂扩散试验、凝集试验、荧光抗体试验、间接ELISA、PCR、间接免疫酶组化法等7种,文章对这些方法进行了综述。     

用免疫荧光法检查进口猪扁桃体涂片诊断传染性胃肠炎的报告

目前世界上大多数国家诊断猪传染性胃肠炎(TGE)多采用免疫荧光直接法检查空肠冷冻切片或涂片,用血清中和试验和免疫荧光间接法检测抗体效价以诊断 TGE病。这几种方法都有较高的特异性,检出率也较高,前一种方法只适用于发病前期的尸检;随着肠绒毛的再生检出率迅速下降,后两种方法检测抗体效价系回顾性诊断。作为进出口检疫时间紧、任务急,迫切需要特     

抗鼻疽菌单克隆抗体的应用研究Ⅰ.免疫荧光间接法对鼻疽菌的检测

应用抗鼻疽菌单克隆抗体(McAb)作荧光抗体间接染色法代替习用的诊断血清检测鼻疽菌,证明McAb对鼻疽菌检测的敏感性高,特异性较强。     

同时检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的环介导间接PCR方法的建立

为建立同时检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的环介导间接PCR方法,本研究根据鸭疫里默氏菌外膜蛋白A基因和大肠杆菌的gapA基因的保守序列设计两对特异性探针,分别标记于猪线粒体基因片段的两端形成两种不同的捕获探针,将捕获探针与待检测菌的基因组杂交、补平缺口、环化后,采用1对引物反向扩增捕获探针,建立检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的环介导间接PCR方法,扩增片段分别为540 bp和328 bp,本研究建立的方法对金黄色葡萄球菌、禽多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌的检测结果为阴性;能够检测出10 pg的鸭疫里默氏菌和大肠杆菌的基因组DNA,与常规PCR的符合率为100%。本研究建立的环介导间接PCR方法是一种特异性好、灵敏度高的快速病原学诊断方法,为同时检测鸭疫里默氏菌和大肠杆菌提供了一种可行的方法。     

猪丹毒杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测猪丹毒杆菌血清抗体的ELISA方法,本研究将猪丹毒杆菌(1a型)云南分离株ZY15074的超声裂解的全菌蛋白作为包被抗原,通过反应条件的优化,建立了猪丹毒杆菌抗体间接ELISA检测方法。特异性试验结果显示该方法与猪其它10种常见病原阳性血清均无交叉反应。该方法对阳性血清的敏感性为1/256。重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于10%。对160份临床血清样品比对试验结果显示该方法与国外间接ELISA方法的符合率为90.6%。本研究建立的间接ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,可以用于猪丹毒杆菌血清抗体检测和流行病学调查。     

单克隆抗体直接ELISA法检测家蚕微孢子虫

本文报道的是将辣根过氧化物酶(HRP)直接标记于单克隆抗体上进行直接ELISA法检测家蚕微孢子虫,实验结果表明:直接ELISA法比间接ELISA法检测家蚕微孢子虫其灵敏度和特异性二者差异不大,但直接ELISA法操作简单,是实用性较强的一种检测家蚕微孢子虫的方法。     

沙门菌PCR快速检测试剂盒的研制与应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的沙门菌检测方法，根据沙门菌fimY保守基因序列设计合成了1对引物，建立了快速检测沙门菌的PCR方法，并对反应条件进行优化，组装成快速检测试剂盒。结果显示，所有沙门菌均扩增出526bp的特异性条带，而非沙门菌均未扩增出任何条带。检测灵敏度达93CFU，还可检出含3CFU的样品用BP预增菌的菌液或用MM增菌后的菌液，而且稳定性良好，冷冻至少能保存12个月。采用直接菌体加入法、热裂解法、反复冻融法、CTAB碱裂解法和柱式试剂盒提取法分别提取核酸模板，结果CTAB法效果最好，但操作烦琐，而直接菌体加入法和热裂解法可以达到和柱式试剂盒提取法相同的效果，且操作简便、快速、经济、效果好。通过对临床样品的检测，证实该试剂盒具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点，值得推广应用。     

猪病毒性腹泻检测基因芯片的两种样品标记技术比较

对猪病毒性腹泻检测芯片的两种样品标记方法进行比较。分别选取猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S和M基因,猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的N和S基因,A型猪轮状病毒(GAR)的VP7和NSP4基因设计引物,用PCR扩增制备靶基因,纯化后制备猪病毒性腹泻联合检测基因芯片。提取样品核酸,采用Cy3直接标记法和间接标记法进行PCR扩增标记,标记的样品再与芯片杂交、扫描和数据分析,同时对两种标记方法的特异性、敏感性等进行了比较。结果表明,两种方法标记的样品均能与基因芯片特异性杂交,但直接法的中位信号值(median)均高于间接法的中位信号值,直接法的芯片杂交信噪比是用间接法的5倍以上。两种标记方法制备样品特异性好,猪蓝耳病毒、猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒验证检测为阴性;直接法和间接法的最低检测浓度分别为10~5和10~7 copies·μL~(-1),前者的灵敏性是后者的100倍。应用优化的直接标记法处理56份临床样品,进行芯片的检测应用,结果与RT-PCR一致。本研究结果表明直接法荧光标记样品可明显提高病毒性腹泻检测芯片的检测效果。     

斑点免疫金渗滤法检测猪瘟抗体的研究

以猪瘟抗原包被硝酸纤维素膜，然后用胶体金标记SPA，建立检测猪瘟抗体水平的斑点免疫金渗滤法检测试纸盒。通过胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)直接显色，阳性者出现红色斑点，结果易于判断。整个试验过程仅需5min，操作简单，与猪兰耳病、猪伪狂犬病、猪细小病毒、新城疫和禽流感等阳性血清不发生交叉反应。同时将该法与目前猪瘟的常规检测方法Dot—ELISA法和间接血凝试验同时对200份猪血清进行猪瘟抗体检测比较，符合率达98．4％和98．9％。说明该法微量、特异、敏感可靠，检测时间短，效果直观，非常适用于猪瘟的早期诊断和普查以及疫苗免疫效果后抗体水平的检测。     

空肠弯曲菌PEB1A蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了建立检测血清中空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）抗体的间接ELISA方法,试验通过PCR扩增并克隆空肠弯曲菌PEB1A基因,构建原核表达载体pET32a-PEB1A,将该表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达获得约47 ku的可溶性目的蛋白,通过Western blotting证明所表达的重组蛋白具有良好的生物学活性。以纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立空肠弯曲菌抗体间接ELISA方法,对其特异性、敏感性、重复性进行检测。结果表明,本试验建立的空肠弯曲菌抗体间接ELISA检测方法临界值为0.3424,本方法仅与空肠弯曲菌阳性血清发生特异性反应,与其他抗血清无交叉反应,具有较强的特异性,批内、批间的重复性试验变异系数均<5%,具有较好的重复性和稳定性。该方法的建立可应用于血清中空肠弯曲菌抗体的快速检测,为进一步防制空肠弯曲菌腹泻提供依据。     

间接ELISA检测禽霍乱血清抗体的研究

比较不同ELISA包被抗原对禽霍乱免疫血清的检测结果,选择最佳的包被抗原建立禽霍乱血清抗体的间接ELISA检测方法.分别 使用超声波裂解抗原、脂多糖蛋白抗原和全菌抗原作为包被抗原,应用间接ELISA方法检测 禽霍乱免疫血清,并对不同抗原建立的ELISA方法进行重复性试验.根据三种抗原对 免疫血清的检测结果以及重复性试验,发现全菌抗原的敏感度、特异性、稳定性均优于其他 两种抗原.全菌抗原作为ELISA包被抗原用于禽霍乱血清学检测具有敏感度高、特异性强、稳定性好的特点.     

PCR法检测犬常见皮肤致病真菌的试验研究

利用PCR检测方法可对犬临床疑似真菌性皮肤病样本进行诊断。笔者选用真菌通用引物,对已知标准菌株及不同微生物进行特异性检测,并对其敏感性进行检测。采用该方法对临床30份疑似为真菌性皮肤病犬病料进行检测并克隆测序,同时对30份病料进行表型分析。结果表明,3种常见皮肤致病真菌(犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌)PCR扩增条带为310 bp;特异性检测结果,该方法检测其他微生物和犬体细胞均为阴性;采用该方法进行PCR检测真菌核酸检测限可以达到100 pg/m L。采用该方法对30份临床病料进行检测,检出12份阳性,经测序7份为犬小孢子菌,4份为石膏样小孢子菌,1份为须毛癣菌。采用传统培养法检测出阳性样本10份,其中6份为犬小孢子菌,4份为石膏样小孢子菌。通用PCR方法与传统培养法相比,检出率无显著差异。与传统的培养鉴定方法相比,PCR检测方法操作简便、特异性和敏感性比较理想,符合率较高,可用于临床犬皮肤真菌病检测和流行病学调查,并具有重要的公共卫生意义。     

快速诊断猪丹毒免疫组织化学方法开发和验证

本研究的目的,是研制一种能够快速检测猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)的免疫组织化学方法(Immunohistochemical,IHC).猪红斑丹毒丝菌血清1a、1b和2型与猪群临床疾病关系最为密切.试验所用血清1a、1b和2型的抗血清在兔体内制备,混合后用于福尔马林固定、石蜡包埋的猪组织(肺、心、脾脏和皮肤)切片.IHC检测结果与用来自实验性攻毒猪(6头抗生素治疗,8头未进行治疗)以及提交艾奥瓦州立大学兽医诊断实验室的田间病例(n=170)的样本直接细菌培养后所获结果进行比较,结果发现,直接细菌培养法的结果与IHC染色分析结果高度一致.本研究表明,IHC法用于检测福尔马林固定、石蜡包埋组织样本的猪红斑丹毒丝菌抗原有高度的灵敏性和特异性.由此表明,在遇到病猪在提交诊断实验室进行诊断前已用抗生素进行了治疗、且组织器官经直接细菌培养结果为阴性的情况下,用IHC法进行诊断尤其有用.此外,研究表明,IHC法对检测皮肤病变中的猪红斑丹毒丝菌抗原特别实用,而这些病变在进行细菌培养时往往显示为阴性.