狂犬病病毒糖蛋白单克隆抗体的制备

用狂犬病病毒BD06株脑毒免疫BALB/c小鼠,制备G蛋白单克隆抗体。将灭活的BD06脑毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,通过间接ELISA法和荧光抗体病毒中和试验法进行4轮筛选,获得6F12、1B12共2株具有中和活性的糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过Western blotting分析和直接免疫荧光检测结果显示,获得一株针对狂犬病病毒糖蛋白构象表位的单抗6F12和一株针对糖蛋白线性表位的单抗1B12。小鼠中和试验结果显示,两株杂交瘤细胞分泌的抗体均具有狂犬病病毒中和活性。结果表明,获得了两株针对狂犬病病毒G蛋白不同抗原表位的中和活性单克隆抗体,为狂犬病病毒特性研究和检测奠定了基础。     

H5亚型禽流感单克隆抗体的研制及应用

以禽流感H5亚型病毒分别免疫BABL／C小鼠，取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用血凝抑制试验(HI)和间接ELISA检测细胞上清液，结果获得了3株抗禽流感H5亚型病毒特异性单克隆抗体，分别命名为186，1D4，7D1；其中1D4株为抗禽流感H5亚型病毒血凝素特异性单克隆抗体细胞株．186株和7D1株为针对禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体细胞株。经3次亚克隆后，100％杂交瘤细胞保持了分泌抗禽流感病毒抗体的能力。这些单克隆抗体小鼠腹水ELISA效价为10^5，HI效价为2^11-12。研究结果表明，所有这些单克隆抗体仅与相应的禽流感病毒株发生特异性反应，而不与鸡新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、鹅副粘病毒等反应。所有这些单抗在禽流感诊断中将发挥重要作用。     

禽传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体制备及其中和抗原表位的鉴定

为鉴定禽传染性支气管炎病毒(IBV)刺突(S1)蛋白的中和抗原表位，本研究通过IBV全病毒免疫BALB/c小鼠，经融合、亚克隆筛选获得了4株稳定分泌抗IBV S1蛋白抗体的杂交瘤细胞株4A11、1B11、5E5和7C9。经鉴定制备的单克隆抗体腹水抗体ELISA效价为10⁶以上，Western blot和间接免疫荧光试验分析显示该单克隆抗体反应性和特异性良好。随后用8种基于S1分型的IBV毒株为试验毒株，同实验室已有的8株IBV S1单抗(1E9、1H1、1E4、3C6、3C7、2F3、2E5、4F9)共12株单抗进行气管环中和活性检测，发现S1蛋白单抗与8种S1亚型的毒株均有不同程度的中和作用。随后，在抗原表位和Western blot分析的基础上，鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域，获得了6个中和抗原表位，其中除⁴¹⁶IQTRTEP⁴²²表位，其他5个表位仍未有相关报道。本研究成功制备出4株特异性识别S1蛋白且具有中和活性的单克隆抗体，不仅丰富了IBV的单克隆抗体库，为今后研究IBV S1蛋白分子结构提供了关键生物材料...     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行分析与鉴定。用CHO细胞表达的IBRV-gD蛋白作为免疫原免疫8周龄的Balb/c小鼠,无菌取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀后,收集腹水,纯化后进行单克隆抗体浓度、纯度、类及亚类、抗体效价、相对亲和常数、Western blot和间接免疫荧光测定。结果表明,筛选到2株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为4G3D4和9D7A7。4G3D4和9D7A7这2株单抗纯化后的浓度分别为2.6 mg/mL、1.6 mg/mL;亲和常数分别为2.30E+10、1.88E+09;抗体亚类均为IgG1,轻链为kappa链;且均能与IBRV发生特异性反应,与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光;间接ELISA测定腹水效价分别为1∶204800、1∶12800。利用CHO细胞表达的IBRV-gD蛋白成功制备了2株单克隆抗体,为下一步建立特异性的IBRV检测方法奠定了基础。     

分泌抗猪流行性腹泻病毒中国变异株S蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

以纯化的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)中国变异株(CH/ZMDZY/11)S蛋白N端高变区(22-380aa)重组蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,以纯化CH/ZMDZY/11全病毒及带His标签的重组蛋白分别为筛选抗原,利用淋巴瘤杂交技术获得了一株稳定分泌抗S蛋白特异性单克隆抗体细胞株,命名为2D1。该株杂交瘤细胞诱生小鼠产生的腹水抗体效价为1∶3 200,免疫球蛋白类型为IgM。ELISA检测该单抗与PEDV流行株及PEDV CV777疫苗株全病毒的反应显著差异,可区分流行毒株和疫苗毒株;但该单抗用于Western blot不能区分PEDV流行株和疫苗株。ELISA及Western blot试验结果显示,该单抗有较好的PEDV特异性,可用于检测PEDV。     

禽呼肠孤病毒S1733株单克隆抗体的制备及特性鉴定

将增殖的禽呼肠孤病毒S1733毒株进行浓缩,然后进行蔗糖梯度纯化,测定纯化后病毒的浓度,按每只鼠100 μg的病毒用量免疫BALB/c小鼠,免疫5次后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 按5∶1进行融合。对融合后的杂交瘤细胞进行筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆。通过间接ELISA方法测定抗体效价,并通过Western blotting、Dot-ELISA、直接免疫荧光和中和反应等方法对2株单克隆抗体特性进行检测。试验结果表明,纯化的病毒含量为43 mg/mL,用纯化的病毒免疫BALB/c小鼠后与骨髓瘤细胞融合,通过克隆筛选成功获得2株能稳定传代并分泌抗禽呼肠孤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株SF6-3K3和SB2-1K3。2株单克隆抗体的腹水经间接ELISA测定效价达10⁵以上,其抗体为IgG1亚类,特异性试验表明其与其他病毒株没有交叉反应,具有良好的特异性,并且这2株单克隆抗体没有中和禽呼肠孤病毒的能力,具有识别禽呼肠孤病毒的能力,可以用于禽呼肠孤病毒的特异性检测。     

基因Ⅶ型新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

为制备基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)的单克隆抗体(MAb),本研究利用JS/17病毒株的HN重组蛋白和活病毒分别免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,并通过ELISA、间接免疫荧光和western blot方法筛选,制备了3株特异性识别HN蛋白的单克隆抗体(MAb)。其中,MAb1D4和4D9具有病毒中和活性(VN)及血凝抑制作用(HI),可以识别多种基因型的Ⅱ类NDV,但与Ⅰ类NDV病毒株无反应。MAb 2G8识别线性表位131DYIGGIGKE139,该表位在各病毒株中高度保守。获得的3株MAb可以用于NDV的鉴定及HN蛋白的功能研究。     

抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

用纯化的Asia1型口蹄疫病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)筛选,有限稀释法克隆,获得了2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H6、5G3,其细胞培养上清效价分别为1:64和1:128,小鼠腹水效价分别为1×10~(-4)和8×10~(-3);ELISA和IFA结果显示,2株单抗仅与Asial型口蹄疫病毒反应,不与O型口蹄疫病毒反应,表明它们均为抗Asial型口蹄疫病毒的型特异性单克隆抗体。westem blot结果显示,2株单克隆抗体均不与全病毒抗原反应,表明它们所针对的抗原表位均为构象表位。相加ELISA试验表明,两株单抗识别不同的抗原表位。经硫氰酸盐洗脱法测定,3H6和5G3的相对亲和力指数分别为1.0 mol/L和1.5 mol/L。这2株单抗的获得为建立口蹄疫病毒检测方法提供了强有力的工具。     

猪五大病毒性疫病免疫预防(一)

<正>1猪口蹄疫猪口蹄疫以防控伊O型为主,但要警惕A型。口蹄疫防控存在病毒血清型多、传播途径多、免疫原性弱等难点。猪口蹄疫仍以免疫预防为主。1.1猪口蹄疫疫苗口蹄疫疫苗有全病毒灭活疫苗和合成肽疫苗。全病毒灭活疫苗是用双毒株生产,有O/MYA98/BY/2010株+O/XJ/10-11株,O/GX/09-7株+O/XJ/10-11株,旧猪毒单毒株灭     

猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)作为抗原免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后,通过聚乙二醇方法进行融合,利用有限稀释法在HAT培养基上筛选杂交瘤细胞,共获得12株既能稳定生长并可以分泌特异性抗TGEV的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为8D2、4H4、5D6、7H10、4C3、9G1、3A2、8G1、5G6、2D7、4D6、6B10。间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光结果表明,获得的12株单抗能特异性识别TGEV,通过间接ELISA做病原检测,显示12株单抗与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PrV)不发生交叉反应。经抗体亚类鉴定,该12株单克隆抗体均为IgG2b。12株抗TGEV的单抗制备成功,为猪传染性胃肠炎病原特性研究和病原快速检测提供了物质基础。     

抗犬细小病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为制备针对犬细小病毒(CPV)的单克隆抗体,以纯化的CPV免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用超速离心纯化的病毒作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,获得3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D9、3G9和4F6。单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶64、1∶64、1∶128,腹水效价为1∶10~4、1∶10~4、1∶10~5。3株杂交瘤细胞的染色体数分别为92、94、98。亚类鉴定结果显示1D9和3G9重链为IgG1,4F6重链为IgG2b,轻链均为kappa链。病毒中和试验表明,单克隆抗体4F6对CPV具有明显的病毒中和活性。交叉试验表明,3株单克隆抗体均可与CPV特异性结合,与其他犬类常见病毒无交叉反应。本研究制备的单克隆抗体为CPV的检测及其感染动物的治疗提供了物质基础。     

传染性法氏囊病病毒VP2单克隆抗体夹心ELISA检测试剂盒的研制

为研制传染性法氏囊病病毒(IBDV)快速检测试剂盒,用重组IBDV-VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞触合,获得3株稳定分泌抗VP2蛋白单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为1D11、2G8和2E5,抗体亚类分别为IgG1κ、IgG2bκ和IgG1κ。间接免疫荧光试验(IFA)证明,3株单抗均与VP2发生特异性反应。相加ELISA证明3株mAb识别VP2不同的抗原表位。在病毒中和试验中,1D11和2G8腹水对IBDV的中和效价分别为104和103,而2E5无中和活性。用亲和层析方法纯化1D11和2E5,分别作为包被抗体和标记抗体,建立了IBDV夹心ELISA检测方法,优化了试验条件,测定了其主要性能指标,对IBDV的最低检出量为102 TCID50/mL。用夹心ELISA、AGP和RT-PCR 3种方法同步检测8种试验样品,夹心ELISA与RT-PCR的检测结果一致,显著高于AGP方法。组装成的试剂盒,置于37℃保存7d、4℃保存6个月和-20℃保存24个月,其检测结果没有显著差异(P>0.05)。     

传染性法氏囊病病毒VP2单克隆抗体夹心ELISA检测试剂盒的研制

为研制传染性法氏囊病病毒（IBDV）快速检测试剂盒,用重组IBDV-VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞触合,获得3株稳定分泌抗VP2蛋白单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株,分别命名为1D11、2G8和2E5,抗体亚类分别为IgG1κ、IgG2bκ和IgG1κ。间接免疫荧光试验（IFA）证明,3株单抗均与VP2发生特异性反应。相加ELISA证明3株mAb识别VP2不同的抗原表位。在病毒中和试验中,1D11和2G8腹水对IBDV的中和效价分别为104和103,而2E5无中和活性。用亲和层析方法纯化1D11和2E5,分别作为包被抗体和标记抗体,建立了IBDV夹心ELISA检测方法,优化了试验条件,测定了其主要性能指标,对IBDV的最低检出量为102 TCID50/mL。用夹心ELISA、AGP和RT-PCR 3种方法同步检测8种试验样品,夹心ELISA与RT-PCR的检测结果一致,显著高于AGP方法。组装成的试剂盒,置于37℃保存7d、4℃保存6个月和-20℃保存24个月,其检测结果没有显著差异（P〉0.05）。     

猪伪狂犬病病毒变异毒株gE和gB蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)疫苗免疫抗体与病毒感染抗体鉴别诊断方法,分别以PRV变异毒株的gE或gB重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选所需单克隆抗体,获得6株抗PRV gE蛋白的单抗(3E6、7E1、7C5、10C3、15C1、14C1)和6株抗PRV gB蛋白的单抗(1C1、5D2、2F11、5G8、10C7、8H5)。IPMA检测结果显示,gE蛋白单抗能识别PRV变异毒株,但不识别疫苗株;而gB蛋白单抗可同时识别PRV变异毒株和疫苗株。gE单抗10C3和gB单抗10C7的ELISA效价和IPMA效价均分别达1∶5×10~(5.0)和1∶8×10~(3.0)以上。所筛选出的单抗均不与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)等其他常见病毒发生交叉反应。gE蛋白和gB蛋白的表达及单抗的制备为PRV感染抗体与疫苗免疫抗体鉴别诊断(DIVA)试纸的研发奠定基础。     

马立克氏病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

以马立克氏病毒814株(MDV-814)作为免疫用抗原,建立了2个MDV特异性单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株—4A6、3D7。鉴定结果表明;两株细胞所分泌的McAb均为IgM类免疫球蛋白,具有MDVⅠ型病毒特异性,无中和反应特性和沉淀反应特性。利用两种McAb对国内标准强毒MDV-京1株进行鉴定,肯定其为MDV-Ⅰ型毒株。     

H3亚型禽流感病毒血凝素特异性单克隆抗体的制备

以H3亚型禽流感病毒(AIV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验(HI)筛选阳性杂交瘤细胞并克隆化。结果获得了4株针对H3亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体,分别命名为1D7、1F9、5A4、5F5。这些单克隆抗体小鼠腹水HI效价为212～214。用H1、H6、H10亚型禽流感病毒各2株,H4、H5、H9和新城疫病毒(NDV)各1株进行特异性试验。结果表明:所有这些单抗仅与H3亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他亚型AIV及NDV反应。用28株H3亚型禽流感病毒进行排谱试验,结果证明:4株单抗均具有广谱性,其中1F9、5A4、5F5与受试的28株H3亚型AIV均反应,而1D7只与其中的26株反应。以上单抗将为控制畜禽及人类的流感提供必需的诊断试剂。     

鸭1型甲肝病毒亚型VP1蛋白单克隆抗体的研制及鉴定

为制备抗鸭1型甲肝病毒亚型（DHAV-1a）结构蛋白VP1的单克隆抗体（MAbs）,本研究以pGEX-VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,同时以纯化浓缩的全病毒作为包被抗原,建立了筛选抗VP1蛋白阳性杂交瘤细胞株的间接ELISA方法,经融合、筛选制备杂交瘤细胞及鉴定MAbs的稳定性、特异性、腹水效价和中和活性等生物学活性,获得了2株持续且稳定分泌抗体的杂交瘤细胞（1A2和5G3）。MAbs腹水ELISA效价分别为1：3.2×10⁴和1：2.0×10⁶。亚类鉴定均为IgG1/κ型。Western blotting结果显示,2株MAbs均能与DHAV-1a VP1蛋白和DHAV-1a全病毒发生特异性反应。特异性试验结果显示2株MAbs能与鸭1型甲肝病毒（DHAV-1）和DHAV-1a发生交叉反应。中和试验结果显示5G3株具有中和活性。结果表明2株MAbs的ELISA效价高、特异性强、稳定性好,均能与DHAV-1和DHAV-1a全病毒发生特异性反应,其中一株具有中和活性。     

抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白特异性单克隆抗体的研制及鉴定

以抗H5亚型禽流感病毒（AIV）JSD株鸡胚尿囊液免疫8周龄BALB/c小鼠,第4次免疫后取其脾淋巴细胞与SP2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验（HI）对杂交瘤进行筛选,经3次亚克隆后,共获得4株针对血凝素（HA）蛋白的特异性单克隆抗体,分别命名为：2D2、2C8、3D3和3D11。该4株单抗的小鼠腹水的HI效价在2^13～2^15,ELISA效价为1.2×10^5～5.1×10^5。亚类鉴定结果表明,2D2和3D11属于IgG1,2C8属于IgG3,3D3属于IgG2a亚类;特异性试验结果表明,上述4株单抗仅与H5 AIV毒株发生特异性反应,而不与其他亚型AIV以及NDV、IBV和EDSV-76等病毒反应;鸡胚中和试验结果显示,4株单抗均具有较好的中和活性。本研究成功获得4株针对H5 AIVHA蛋白的特异性单抗,为临床H5 AIV的血清学监测及鉴定提供了必需的试剂。     

核酸免疫制备抗猪流感病毒HA单克隆抗体

为制备H1N1猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),本试验利用表达猪流感病毒A/Swine/Guangdong/2004(H1N1)毒株HA蛋白的表达质粒pVAX1-HA肌注股内肌免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合;通过间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆,获得9株稳定分泌抗HA单克隆抗体的杂交瘤细胞。中和试验结果显示,单克隆抗体4D5株对H1N1流感病毒起中和作用,该单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶1024。这株单克隆抗体与哈尔滨兽医研究所国家重点实验室保存的H3N2流感病毒、H5N1流感病毒均不发生交叉反应,显示出了很好的H1特异性;间接免疫荧光试验结果显示,这株单克隆抗体能与H1N1流感病毒发生特异性反应。制备的特异性抗HA单克隆抗体为建立H1N1流感病毒免疫学检测方法和单链抗体抗病毒复制研究奠定了基础。     

小鹅瘟病毒单克隆抗体的制备及特性鉴定

为了建立快速、简便的番鸭小鹅瘟病诊断方法,用纯化的小鹅瘟病毒（Goose parpovirus,GPV-PT）免疫BABL/c鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA和间接免疫荧光检检（indirect immunofluorescence assay,IFA）筛选,获得3株能稳定分泌抗GPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株（分别命名为D11、7-7和E16）。三株单抗的免疫球蛋白亚类分别为IgM、IgG3和IgM,3株单抗均具有ELISA、IFA和中和特性;其中两株（D11和E16）具有致敏胶乳特性;特异性测定显示3株单抗仅与GPV反应,而与番鸭细小病毒（Duck parpovirus,MPV）、番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV）、禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）、鸭副粘病毒（Paramyxovirus,PMV）、鸭肝炎病毒（Duck hepatis virus,DHV）、正常细胞和胚液等均无交叉反应;在-20℃保存期为18个月。结果表明3株单抗均具有良好的特异性,为研制免疫学快速诊断奠定了基础。