秀丽隐杆线虫fat-1基因密码子优化、克隆及家兔表达载体构建

提取秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)总RNA,采用RT-PCR法扩增出fat-1基因cDNA全长.根据家兔基因密码子使用偏好性,对引自GenBank的fat-1 cDNA序列进行密码子优化,通过全基因合成的方法获得优化后的fat-1基因(命名为opfat-1).将扩增的fat-1 cDNA和opfat-1基因分别与pGEM-T Easy和pUC57载体连接,转化大肠杆菌DH5α,获得2种重组克隆子.2种重组子经双酶切后获得的目的片段分别定向克隆入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组表达载体,并对其进行PCR、限制性内切酶酶切分析和测序鉴定,结果表明,成功构建了fat-1基因家兔表达载体pEGFP-opfat-1和pEGFP-fat-1,且读码框正确.     

捻转血矛线虫肌动蛋白基因的克隆与表达及其DNA疫苗的构建

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,该基因获得了表达,且以包涵体的形式存在,融合蛋白相对分子质量约46×103。以此重组蛋白为抗原,用自然感染捻转血矛线虫山羊血清为第一抗体进行Western blot分析,结果出现1条特异性条带,表明捻转血矛线虫Actin蛋白在自然感染过程中能被宿主的免疫系统识别,可能是一种天然抗原。用纯化重组Actin蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清为第一抗体进行Western blot,结果发现该血清能识别捻转血矛线虫成虫蛋白谱中相对分子质量约为42×103的蛋白条带。将捻转血矛线虫actin基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了DNA疫苗pVAX1-ACT,动物免疫试验结果表明该DNA疫苗在机体内获得了表达。     

大鼠OSP-1启动子克隆与表达检测

[目的]克隆大鼠卵巢特异性启动子（OSP-1）片段,并在细胞水平检测该启动子调控标记基因的组织特异性表达。[方法]参考已知大鼠OSP-1序列设计特异性引物,PcR扩增大鼠OSP-1启动子片段并与已公布的大鼠OSP—1序列进行比较。将OSP-1启动子定向克隆到去除CMV的pEGFP—N1载体,构建真核表达载体pOSP—1—EGFP．N1;重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000介导下,分别转染水牛的颗粒细胞、乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞,并于转染后12,24和48h在荧光显微镜下观察EGFP表达情况。【结果lOSP—l启动子扩增片段长480bp,与已公布的大鼠OSP-1序列的相似性达96％;应用启动子预测软件对所得序列分析表明,该扩增片段含有类似于TA—TAbox和CAATbox的核心启动顺式元件,并含有多个C／EBPbeta转录因子的结合位点;在颗粒细胞转染后12h可观测到绿色荧光表达,转染后24h荧光细胞增多,细胞形态均呈圆形、体积较大,48h荧光细胞数量骤减,且死细胞增多;在乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞均未检测到EGFP基因表达。[结论]大鼠OSP-1启动子控制下的EGFP基因可在水牛颗粒细胞中特异表达,为构建水牛卵巢特并性表达转基因载体奠定了基础。     

基于西门利克森林病毒复制子的"自杀性"DNA疫苗载体的构建及其体外表达特性

对西门利克森林病毒(SFV)复制子质粒型表达载体pSfV1进行改造，即在SFV非结构蛋白(nSPs)上游插入依赖于RNA聚合酶Ⅱ的人巨细胞病毒立即早期启动子／增强子序列(hCMV IE Pro／Enh)，同时在pS-FV1的多克隆位点下游插入SV40 poly(A)终止信号序列，获得可以完全在DNA水平上操作并具有自主复制功能的表达载体pSFV-DNA。为了进一步探讨改造载体的转染效率、表达能力以及是否能诱导细胞凋亡等特性，将报告基因EGFP插入pSFV-DNA中亚基因组启动子下游，构建的重组表达质粒pSFV-EGFP转染BHK-21细胞，转染后12h即可观察到荧光，但转染效率明显低于直接由hCMV IE Pro／Enh驱动的EGFP真核表达质粒pEGFP-C1；提取转染后48h的细胞基因组DNA，电泳发现pSFV-EGFP转染细胞均呈典型的DNA断裂(ladder)，而pEGFP-C1转染细胞未观察到这种现象。上述结果表明：改造的载体不仅可完全在DNA水平上操作，而且能正确表达外源基因和诱导细胞凋亡，为开展各种病原微生物的“自杀性”DNA疫苗研究提供了良好的工具。     

bcl-2/EGFP融合基因真核表达质粒的构建

为深入研究bcl 2对细胞凋亡的调控机制和肿瘤发生发展的影响,应用基因重组手段,根据表达载体pEGFP C1上的多克隆位点和bcl 2基因序列设计了1对引物,对含有bcl 2基因的质粒pWB bcl进行了PCR扩增,得到了708bp的目的片断。将其克隆到pMD18 Tvector,筛选阳性克隆并测序,序列分析表明,其与原初序列同源性达99%。将bcl 2插入到载体启动子下游,与报告基因绿色荧光蛋白(EnhancerGreenFluorescentProtein,EGFP)融合,经限制性内切酶酶切和PCR鉴定,证明Bcl 2/EGFP真核表达质粒构建成功。     

含O型FMDVP1-2A、3CC基因和EGFP基因表达盒的构建

采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMDI8-T载体,分别得到重组载体pUCll9-P1-2A和pMDI8-T-3C;将重组载体pUCll9-P1-2A用HindⅢ、BamH I酶切,重组载体pMDI8-T-3C用BamH I、Nhe I酶切;利用酶切所得到的基因片段P1-2A、3C有共同的BamH I酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMDI8-T-P1-2A-3C.,将基因P1-2A-3C与启动EGFP表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A3C,并进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定.结果表明:试验成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的表达盒p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C.     

含O型FMDVP1-2A、3C基因和EGFP基因表达盒的构建

采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMD18-T载体,分别得到重组载体pUC119-P1-2A和pMD18-T-3C;将重组载体pUC119-P1-2A用HindⅢ、BamHⅠ酶切,重组载体pMD18-T-3C用BamHⅠ、NheⅠ酶切;利用酶切所得到的基因片段P1-2A、3C有共同的BamHⅠ酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMD18-T-P1-2A-3C.将基因P1-2A-3C与启动EGFP表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C,并进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定.结果表明:试验成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的表达盒p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C.     

fat-1基因密码子优化及在家兔胎儿成纤维细胞中的初步表达

根据家兔基因密码子使用偏好性,对引自GenBank的秀丽隐杆线虫fat-1基因编码序列进行密码子优化,通过全基因合成的方法获得优化后的fat-1基因(命名为opfat-1);从秀丽隐杆线虫中RT-PCR扩增获得fat-1.将扩增的fat-1和合成的opfat-1基因分别构建到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中.采用脂质体LipofectamineTM转染法将fat-1和opfat-1基因转入家兔胎儿成纤维细胞(Rabbit fetal fibroblast cells,rFFCs)中.对比不同DNA和转染试剂用量以及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间探讨影响rFFCs转染效率的参数,经过优化,最优的rFFCs转染条件为:LipofectamineTM用量2～3μl,DNA量0.8～1.0μg,LipofectamineTM与DNA、细胞共培养时间为8 h.通过绿色荧光标记和RT-PCR检测转染细胞中融合蛋白和目的基因的表达.密码子优化的opfat-1与fat-1相比,体外瞬时表达效率有极为显著的提高;G418抗性筛选获得转基因单克隆细胞,RT-PCR初步验证fat-1和opfat-1基因均在家兔胎儿成纤维细胞中稳定转录表达.     

白菜型油菜BrDAD1基因的克隆及其植物反义载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了白菜型油菜BrDAD1基因及自身的启动子基因Pro-DAD1,并将其分别克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了该基因及启动子全序列。结果表明,该基因及启动子全长分别为1 270 bp与1 335 bp。将白菜型油菜BrDAD1基因反向克隆到植物表达载体pCambia 1300的自身启动子基因Pro-DAD1启动子下游,构建了该基因的植物反义表达载体pCamDAD1。     

棉铃虫中肠Cry1A受体蛋白氨肽酶N1在Tn细胞系的表达

 【目的】将棉铃虫中肠Bt受体蛋白在真核表达系统中成功表达。【方法】用PCR方法分别扩增出对Cry1Ac毒素敏感和抗性棉铃虫的中肠氨肽酶N1（APN1）基因的去信号肽片段,将其克隆至pUC 19载体,测定核酸序列后,克隆入Bac-to-Bac表达系统中杆状病毒转移载体pFastBacHTB中多角体基因启动子的下游,筛选出重组质粒pFastBacHTB/APN1并转化大肠杆菌DH10Bac,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组载体Bacmid/APN1。转染粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）细胞（Tn-5B1-4）,获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,得到表达的蛋白。【结果】SDS-PAGE分析和点杂交显示,目的基因得到了成功表达。【结论】APN1基因在Tn细胞中成功表达,为今后继续研究其功能和与抗性的关系奠定了基础。     

利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究

利用pSUMO表达载体在大肠杆菌中高效可溶性表达若干种外源蛋白,如鼠源成纤维细胞生长因子(FGF)-21、人源FGF-21、人源白细胞介素(IL)-1β,并与pET-30a(+)及pTYB11表达系统作比较。将鼠源FGF-21、人源FGF-21及人源IL-1β基因分别亚克隆至pSUMO表达载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白,透析后利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得纯度较高的成熟蛋白。上述基因在pET-30a(+)及pTYB11中表达量极低,考马斯亮蓝染色几乎检测不到。在pSUMO表达体系中这些基因均以可溶形式表达,且可被SUMO蛋白酶I有效的切割,获得纯度较高的成熟蛋白。上述蛋白可在pSUMO表达系统中获得高效可溶性表达。     

TAT-Apoptin基因原核表达载体的构建及其表达鉴定

为得到TAT-Apoptin 融合蛋白,以pMD-19T-Apoptin 为模板PCR 扩增出TATApoptin 基因,构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,并对TAT-Apoptin 蛋白进行表达。PCR 和测序表明,成功构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,进一步对其进行蛋白表达,发现该蛋 白能与Apoptin 多抗发生特异性结合。以上结果证明,TAT-Apoptin 基因原核表达载体构建成 功,并能在Rosetta 中进行分泌性表达。     

小麦甲基结合蛋白基因MBD3重组表达载体的构建和原核表达

DNA甲基化在基因表达调控过程中发挥重要作用,甲基结合蛋白(Methy1-Binding Domain Protein, MBD)是能特异识别甲基化位点的反式作用因子.开展植物MBD基因的功能研究对于探讨植物生长发育的表观遗传学调控机制具有重要意义.该研究构建了小麦甲基结合蛋白基因MBD3的原核表达载体pGEX-4T-MBD3,转化大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株,在37℃,lmMIPTG浓度条件下,成功诱导表达了的GST-MBD3融合蛋白,大小为49.6kDa,这为进一步开展MBD3的蛋白纯化和功能分析奠定了基础.     

烟草质膜ATPase4基因的克隆、表达载体构建及表达分析

植物细胞质膜ATPase基因表达可以引起细胞向外界环境释放H⁺,从而形成细胞膜内外的电化学式梯度,促进各种离子的运输,抵抗外界的各种胁迫。为研究ATPase基因在烟草中的非生物胁迫调控机制及相关生物学功能,本研究采用同源克隆的方法,从普通烟草K326中克隆到了1个ATPase4同源性基因,成功构建ATPase4-pcambia1300过表达载体。利用生物信息学分析ATPase4基因编码蛋白的疏水性、理化性质、蛋白结构预测、信号肽预测、磷酸位点预测及同源性分析,结果显示,该基因与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)质膜ATPase4具有99%同源性,故命名为质膜ATPase4基因。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)测定该基因在烟草组织中的表达量及其在非生物逆境胁迫中的表达模式,结果表明,该基因在根中表达量最高,且能快速响应低钾、高盐、PEG和冷胁迫诱导,说明ATPase4基因在烟草逆境胁迫中发挥着重要的调节作用。     

硫化物醌氧化还原酶定向表达载体的构建及细胞转染表达检测

为建立硫化物醌氧化还原酶(SQR)的肠道定向表达载体,同时通过转染小鼠肠道上皮细胞确定载体的有效性,本试验采用重叠PCR、中间载体法、酶切连接法获得重组载体,通过脂质体转染法将重组载体转入小鼠肠道上皮细胞,并鉴定重组载体的特异性表达。结果显示,成功构建了以肠脂肪酸结合蛋白质(IFABP)为启动子的SQR肠道定向表达载体pc DNA3.1(-)-IFABP-SQR-GFP,并在小鼠肠道上皮细胞中检测到表达的融合绿色荧光蛋白质(GFP)。表明IFABP启动子能够在肠道细胞中定向启动SQR的表达。     

重组hIL-24原核表达载体的构建及表达

采用基因克隆的方法构建人白细胞介素(hIL-24)基因的原核表达载体pET-28a(+)-hIL24,在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白rhIL-24,SDS-PAGE和Western blotting分析蛋白表达,探讨其最佳诱导表达条件.结果表明:hIL-24基因的表达产物分子质量约25 ku,且以包涵体的形式存在于超声裂解后的沉淀中,重组蛋白rhIL-24可特异性被鼠抗人IL-24单克隆抗体识别.当IPTG终浓度为0.5 mmol·L~(-1)、37℃诱导8 h时,其表达量最高.hIL-24基因在该原核表达系统中的成功表达,为其生物学功能的研究奠定了基础.