供体细胞来源及预处理对牛体细胞核移植效率的影响

以牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体细胞,比较了不同同步化诱导方式(血清饥饿法与接触抑制法)、供体细胞冷冻与否、供体动物性别与年龄等因素对体细胞核移植效率的影响。结果表明,接触抑制法处理的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于饥饿法(P<0.05);未冷冻的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于冷冻供体细胞(P<0.05);成年母牛供体的囊胚率显著高于成年公牛(P<0.05);不同年龄供体细胞的核移植胚囊胚率差异不显著(P>0.05)。试验表明,以接触抑制法诱导未冷冻成年母牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体,有利于核移植胚囊胚的发育。     

黄牛供体细胞处理及冷冻保存对核移植率的影响

本试验以延边黄牛耳部皮肤成纤维细胞作为核移植供体细胞,研究不同的供体处理方式对体细胞核移植胚胎发育的影响。使用血清饥饿和汇合处理供体细胞,并进行了体细胞的冷冻保存,研究冷冻后的核移植效果。结果显示:(1)使用血清饥饿处理和汇合处理后,均能提高重组胚的卵裂率及囊胚发育率。(2)未冷冻组重组胚卵裂率及囊胚发育率显著高于冷冻组(P<0.05)。     

供核细胞来源对猪克隆胚胎发育的影响

为研究不同组织来源的供核细胞对猪体细胞核移植胚胎发育能力的影响,分别采用颗粒细胞、耳成纤维细胞和尾成纤维细胞作为供核细胞,移入体外成熟的猪去核卵母细胞中形成重构胚,培养后对比其卵裂率和囊胚率。结果表明：以耳成纤维细胞作为供核细胞的重构胚的囊胚率最高,为17．8％,显著高于颗粒细胞（11．4％）（P〈0．05）。在卵裂率方面,两者无显著差别,分别为65．6％和61．9Voo（P〉o．05）。猪尾尖成纤维细胞的发育能力最差,卵裂率仅为20．2％且未获得囊胚,与其它两组差异显著（P〈O．05）。因此,耳组织来源的成纤维细胞作为供核细胞组织来源丰富且细胞易于传代和保存,以此为供核细胞的重构胚发育能力强,适合作为供核细胞。     

共培养体系中滋养层细胞对牛核移植胚胎早期发育的影响

利用活体取卵(OPU)所得的卵母细胞与牛耳成纤维细胞构建牛体细胞核移植重构胚,并将所得的重构胚进行ACM(培养液)与不同滋养层细胞的共培养,分析不同滋养层细胞类型、传代次数、冻融处理对核移植胚胎体外发育的影响,探讨胚胎体外共培养中滋养层细胞的合适条件。结果表明:胎鼠成纤维细胞(MEF)培养组的囊胚率和胚胎细胞数(38.2%和135±2.1)显著高于牛颗粒细胞(GC)组(9.1%和101±4.6,P<0.05)和牛耳成纤维细胞(BAF)组(25.9%和115±3.1,P<0.05)。2～4代MEF细胞与胚胎共培养的效果(38.2%和135±2.1)明显好于原代MEF细胞(24.7%和108±3.1,P<0.05)或5～8代MEF细胞(22.8%和102±2.8,P<0.05),新鲜的MEF细胞比冻融处理后的MEF细胞培养效果好(38.2%vs.27.7%,135±2.1vs.110±1.7,P<0.05)。因此,用新鲜的2～4代MEF细胞作为共培养体系中的滋养层细胞有利于牛核移植胚胎的早期发育。     

卵母细胞和供核体细胞质量对牛体细胞核移植效率的影响

将未成熟牛卵母细胞进行体外成熟培养,挤压法去除卵母细胞核,以牛耳成纤维细胞作为供核细胞进行体细胞核移植研究,观察形成囊胚组与未形成囊胚组平均每卵巢获卵数、卵母细胞体外成熟率、供核体细胞细胞传代次数、饥饿天数的差异。结果表明:形成囊胚组平均每卵巢获卵数(4.90枚)和体外成熟率(63.9%)均显著高于未形成囊胚组(分别为4.05枚、48.4%)。形成囊胚组供核体细胞代数(4.7代)和血清饥饿天数(4.7d)与未形成囊胚组(分别为6.1代、4.4d)无显著差异。卵巢质量和卵母细胞质量是决定能否形成克隆囊胚的重要影响因素,在供体细胞传代3～8代、饥饿1～9d的范围内,供体细胞传代次数和血清饥饿处理时间对克隆效率无显著影响。     

线粒体损伤对山羊-绵羊异种核移植胚早期发育的影响

【目的】研究线粒体损伤对核移植胚早期发育的影响。【方法】用经光敏化染料罗丹明-123损伤的山羊胎儿成纤维细胞和绵羊卵母细胞,构建山羊-绵羊异种体细胞核移植胚,于38.5℃、相对湿度100%、体积分数5%CO2条件下培养,统计其2-细胞期、8-细胞期和囊胚期的发育率。【结果】山羊核供体线粒体损伤并不影响囊胚期前核移植胚的发育率(P0.05);绵羊卵母细胞线粒体损伤,使核移植胚2-细胞期的发育率下降(P0.05),但不影响8-细胞期和囊胚期的发育率(P0.05);核供体和卵母细胞线粒体都损伤的核移植胚发育率的变化规律与卵胞质受体线粒体损伤的核移植胚一致。【结论】在异种核移植胚的早期发育中,核供体线粒体损伤不影响核移植胚的发育,但卵母细胞受体线粒体损伤明显影响核移植胚的发育率。     

体细胞克隆牛生产效率的影响因素

体细胞克隆牛生产效率受实验室环节和胚胎移植环节等多种因素的影响。依据前期试验结果,重点分析了胚胎移植数量、季节变化和胚胎移植受体牛生理状态等因素对体细胞克隆牛生产效率的影响。结果表明:移植2枚胚胎比移植1枚胚胎和3枚胚胎能获得较高的妊娠率和产犊率及较低的流产率;在春、夏和秋季(5~9月)进行胚胎移植的效果显著优于冬季(12~1月);A、B级黄体受体牛的妊娠率显著高于C级黄体受体牛的妊娠率。胚胎移植数量、移植季节和受体牛生理状况均能显著影响克隆牛的生产效率。     

猪体细胞胞质注射核移植研究

首例体细胞克隆动物“多利”羊诞生以来,各种体细胞核移植动物相继成功克隆,但其克隆效率很低（低于10％）以及大都表现出不同程度的器官衰竭或发育畸形等。猪体细胞核移植在异种器官移植和克隆性治疗上具有重大意义,但其克隆效率更低（1%-2％）。利用胞质注射技术对比不同供核细胞、是否经血清饥饿和不同时间段激活对重构胚发育的影响,在其重构胚卵裂率上,试验结果表明：颗粒细胞与胎儿成纤维细胞无显著差异（43．37％,45．98％;P〉0．05）;血清饥饿与否无显著差异（45．61％。50．71％;P〉0．05）;在核移植后1-3h和3-5h激活显著高于立即激活（51．82％,56．98％。8．51％;P〈0．05）。     

不同类型供体细胞对牛体细胞重构胚发育能力的影响

通过显微操作去除体外成熟培养22￣23h卵母细胞的细胞核,并通过细胞质内注射法将供体细胞核移入去核卵母细胞内构建重组胚,重组胚经离子霉素(Ionomycin)激活5min后,再在6-DMAP内培养4h,将重组胚转CR1培养液中进行培养,24h和36h检查卵裂率,培养8d后统计囊胚发育率。比较了经血清饥饿和未饥饿牛成纤维细胞、颗粒细胞作为供体细胞构建的重组胚。研究发现:未饥饿组的牛成纤维细胞重组胚囊胚发育率(11.76%)显著高于血清饥饿组重组胚囊胚发育率(3.16%,p<0.05)。未饥饿组颗粒细胞囊胚发育率(14.94%)也显著高于血清饥饿组(7.14%,p<0.05)。经血清饥饿处理的颗粒细胞和成纤维细胞重组胚发育率差异不显著(p>0.05),未饥饿处理组两种细胞的重组胚发育率差异不显著。结果表明,用非饥饿处理牛成纤维细胞及颗粒细胞重组胚的发育率较高,牛颗粒细胞更有利于重新程序化。     

胚胎移植时机对牛体细胞克隆胚胎妊娠率的影响

以活体取卵OUP来源的牛卵母细胞为受体胞质,以Holstein奶牛的牛耳成纤维细胞作为供核细胞进行体细胞克隆．并将发育7d的克隆囊胚和体内胚分别及体外胚进行移植,观察移植时机对受孕率的影响。依据代孕牛排卵后天数的不同分为3个实验组,组1：排卵后5-6d（不含6d）;组2：排卵后6—7d;组3：排卵后7～8d（不含7d）。结果显示：对于体外胚胎而言,第2组的受孕率高于第1组（P〉0．05）,第3组的受孕率最低（Pt0．05）,且120d的受孕率为0。与此相反,对于体内胚胎。第3组的受孕率高于其他2组。通过实验可以证明对于7d的体外胚胎选择在代孕牛排卵后6—7d移植可以得到较高的受孕率：而对于体内胚胎而言则应选择在受体牛排卵后7—8d移植,可得到较高的妊娠率。     

供体细胞的传代次数和不同处理方法对异种核移植效率的影响

实验旨在探讨供体细胞培养代数及其所处的细胞周期对异种核移植效率的影响.以经Hochest33342染色后去核的牛卵母细胞为受体,以处于不同细胞周期的不同代数的人成纤维细胞为供体,采用电融合方法构建重构胚,6-DAMP和乙醇激活重构胚,SOFaa培养液中培养.第20代细胞非饥饿组的融合率、发育率显著低于第20代饥饿组（P＜0.05）,极显著的低于第8代细胞的饥饿组和非饥饿组（P＜0.01）,而8-细胞胚胎率,囊胚率4组间无显著差异.结果表明,饥饿处理对于培养代数低的细胞来说可能是非必要因素,但对于高代次细胞则是提高核移植效率的必要步骤,饥饿处理可使核移植融合率和发育率显著的提高.     

Serial Nuclear Transfer of Goat-Rabbit Interspecies Reconstructed Embryos

The experiments of serial nuclear transfer were conducted between Boer goat and rabbit. The enucleated oocytes of rabbit were used as recipients while the blastomeres of goat morula was used as nuclear donor. The reconstructed embryos developing to morula were used as donor for serial cloning. As a result, two generations of reconstructed embryos were obtained, including 58 first generation reconstructed embryos and 14 second generation reconstructed embryos. The fusion rates were 79.5 and 70%, respectively, and there was no significant difference between them （P〉0.05）. The cleavage rates were 75.9 and 28.6% respectively with significant difference （P〈0.01）. No blastocyst was obtained from the second generation reconstructed embryos while 13.8% of first generation reconstructed embryos developed to blastocyst.     

野生盘羊与巴什拜羊第二代杂种羔羊生长发育规律的研究

对野生盘羊与巴什拜羊第二代杂种羔羊生长发育进行测定,通过对第二代杂种羔羊初生前的生长发育、哺乳期的生长发育测定,并且绘制了累积生长、绝对生长和相对生长曲线图.计算分析生长发育的速度、强度等指标,并与纯巴什拜羔羊比较.测定结果表明:第二代杂种羔羊在胚胎期四肢生长强度比躯体强,这一点继承了盘羊的遗传特性;从初生到断奶期间躯体的生长速度和强度较好,这方面继承了巴什拜羊早期生长发育快的遗传特征,但在体尺指标和外部特征上野生基因占优势,为今后巴什拜羊与野生盘羊杂交改良工作提供科学依据.     

牛乳腺干细胞核移植

近些年来,体细胞核移植虽然取得了很大的进步,但核移植效率仍然很低,而供核细胞的选择对于核移植效率起着关键的作用.本研究针对牛乳腺干细胞(mammary stem cells,MSCs)和牛乳腺上皮细胞(mammary epithelial cells,MECs)作为核移植的供核细胞,比较了重构胚发育率和核移植胚胎干细胞分离率的差异,发现来源于MSCs的重构胚的卵裂率为69%(331/479),囊胚发育率为27%(130/479);来源于MECs的卵裂率为71%,囊胚发育率为17%(84/495).囊胚发育率差异显著(p＜0.05).试验从176个核移植重构囊胚分离培养胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells),发现来源于MSCs的重构胚的NTES贴壁率为44%(39/88),来源于MECs的NTES贴壁率为28%(25/88),NTEs的贴壁率差异显著(p＜0.05).以上数据表明,来源于MSCs的重构胚具有较高的发育潜能.     

导入野生盘羊瘦肉基因培育巴什拜羊新品系

对野生盘羊与巴什拜羊进行导入杂交和回交,通过对杂交一代和一、二代回交后代生长发育、肉用表型、脂臀大小、外形体质、肉成分的变化进行观察及测定,并与纯巴什拜羔羊进行了比较。结果表明,一、二代回交后代羔羊在体尺指标和外部特征上野生基因占优势,脂臀减少,有些母羊几乎没有脂臀,脂肪含量和胆固醇含量降低,蛋白质含量和瘦肉率明显提高。早期的生长速度和强度较好,继承了巴什拜羊早期生长发育快的遗传特征。     

动物异种核移植的研究进展

论述了种间核移植的历史发展现状、应用前景和存在问题以及体细胞核移植技术在研究核质互作、细胞核的分化和重新编程方面重要的理论意义。     

受体牛黄体位置及黄体等级对胚胎移植效果的影响

为探索黄体等级和黄体位置对胚胎移植后受体牛妊娠率的影响,便于在应用中准确判断受体牛是否可以进行移植,整理、统计分析了137头移植受体牛的记录资料,结果表明:"2次PG"法和"CIDR PG"法处理受体牛,对形成黄体的等级没有影响;同期发情处理后,受体牛A、B、C级黄体的移植妊娠率分别为47.37%、42.86%和48.34%,黄体等级之间无明显差异(p>0.05);左、右侧黄体的妊娠率分别为43.63%和47.56%,移植时黄体存在的位置与移植妊娠率没有明显差异(p>0.05)。     

小鼠卵母细胞去核时间对卵丘细胞核移植的影响

对超数排卵的小鼠分别在注射HCG后14~16,16~18,18~20和20~22h采小鼠卵母细胞用于核移植,观察小鼠卵母细胞的去核时间在体细胞核移植中的作用。结果显示,在注射hCG后14~16,16~18,18~20和20~22h,小鼠卵母细胞去核效率分别为80.09%(338/422),73.12%(283/387),55.02%(230/418)和48.74%(193/396);重构胚激活率分别为66.20%(190/287),75.43%(175/232),84.78%(156/184)和85.14%(126/148);重构胚的囊胚发育率分别为13.94%(40/287),7.33%(17/232),3.80%(7/184)和1.35%(2/148)。试验证实小鼠卵母细胞在注射hCG后14~16h进行去核较为适宜。     

山羊（Bore）-兔异种克隆胚胎连续核移植的研究

 以山羊-兔异种克隆桑椹胚卵裂球为核供体，兔卵母细胞为受体进行连续核移植研究，最终连续2次，共获得继Ⅰ代重构胚58枚，继Ⅱ代重构胚14枚。融合率分别为79.5%和70%，差异不显著（P>0.05）卵裂率分别为75.9%和28.6%,差异显著（P<0.05）。但继Ⅱ代重构胚最终未能发育至囊胚，继Ⅰ代重构胚囊胚率达到10.2%。     

新疆野生盘羊TLR9基因的克隆·序列分析及其编码氨基酸结构预测

[目的]克隆鉴定新疆天山亚种野生盘羊Toll样受体9（TLR9）基因,预测其结构与功能,并对序列进行分析。[方法]以外周血液的总DNA为模板,运用PCR方法分3段克隆了新疆野生盘羊TLR9基因,PCR产物经凝胶回收纯化后测序,并运用分子生物学软件将测序结果进行分析及结构预测。[结果]克隆得到的新疆野生盘羊TLR9基因大小是3 192 bp,含1个完整的开放阅读框（ORF）,共编码1 064个氨基酸,其氨基酸组成中亮氨酸的含量高达18.51%,含有30个氨基酸的信号肽序列;在野生盘羊TLR9蛋白455～4757、40～760和780～800位氨基酸有3个跨膜区;新疆野生盘羊TLR9蛋白的3D结构是由胞外段富含亮氨酸的重复序列（LRR）和胞内段TIL（Toll/IL IR）结构域构成的。[结论]上述结构特征为TLR9发挥生物学功能奠定了基础,同时也为进一步研究新疆野生盘羊TLR9基因提供了理论依据。