利用SAGE方法分析家蚕基因表达数目的初探

SAGE(serial analysis of gene expression)是基因表达水平差异分析和大规模发现新基因的分子生物学技术。已构建了家蚕卵、幼虫、蛹、成虫等4个不同发育时期的SAGE表达库,经测序分别得到69 100、62 232、63 966和62 666个基因标签序列,其中特异标签数目依次为17 718、13 243、14 044和15 224。这些特异标签数目即为家蚕在这4个不同发育时期的基因转录本数量。根据测序数与获得标签的数量动态监测,发现测序的数目尚未达到饱和,因此基因转录本的数目还可能会有所增加。在上述研究的基础上,利用SAGE数据为基础,采用双倒数作图求最大值的方法,推测出了家蚕在4个不同发育时期的基因表达数目,同时也发现家蚕卵期的基因表达数目远远大于其它3个时期。     

应用基因表达系列分析(SAGE)技术研究高温处理前后家蚕的基因表达差异

高温对家蚕的生理和免疫能力有明显影响。为从分子水平上探究家蚕抗高温机制,应用基因表达系列分析(SAGE)技术获得家蚕5龄雌蚕高温处理前后中肠、丝腺和脂肪体组织的基因表达谱,构建高温组(34℃)和常温组(26℃)2个家蚕SAGE文库。2个家蚕SAGE文库分别包含3555107和3580976个原始标签,其中的标签种类分别为113684和131 296个,清洁标签的种类分别为45972和49467。比较2个文库清洁标签获得65 535种差异标签,共注释4249个基因,其中有1 062个差异表达的基因(P<0.05,错误检测率FDR≤0.001并且拷贝数的差异在2倍以上)。经GO分析发现2个文库中基因的分布极其相似,表明这些基因在不同的环境温度下有类似的生物学功能并参与类似的生理代谢过程。KEGG pathway分析显示有732个基因涉及176个KEGG路径,其中有40个为差异表达基因显著富集的路径(P<0.05),超过一半的路径与代谢、生物合成和信号传导有关。上述结果有助于对家蚕抗高温基因的鉴定以及探究基因调控的网络关系。     

EST规模测序在家蚕功能基因组中的应用

EST(Expressed Sequence Tag)指的是一组cDNA的部分序列，一般长度为300-500bp，是由大规模随机取出的cDNA克隆一次测序得到的组织或细胞基因组的表达序列标签。一个EST代表生物某一时期的某种组织或细胞的一个表达基因。对整个基因组表达基因的功能及调控研究就称为功能基因组研究。     

家蚕脂肪体组织基因表达谱的研究I．家蚕5龄中期幼虫脂肪体组织基因表达分析

以大规模EST测序为基础，用生物信息学方法分析了家蚕5龄3d脂肪体组织基因表达的特征，共获取脂肪体组织EST 12 721个。经Plarap程序拼接得到2316个非冗余序列，其中包括824个contigs，l492个singletons。在鉴定出的已知基因中，基因表达频率有明显差异：物质代谢相关基因表达量最高，占总量的58．2％；其次为转录翻译调节相关基因和酶类基因，分别占15．5％和14．5％。在高量表达基因中，有贮藏蛋白、蛋白酶抑制剂、类IDGF蛋白、抗菌蛋白、谷胱甘肽-S转移酶等。结果表明，脂肪体组织基因表达的种类很多，特征明显，与脂肪体在蚕体内的贮藏功能、蛋白质合成功能、代谢调节功能以及变态发育有密切关系。     

家蚕脂肪体组织基因表达谱的研究Ⅰ.家蚕5龄中期幼虫脂肪体组织基因表达分析

以大规模EST测序为基础 ,用生物信息学方法分析了家蚕 5龄 3d脂肪体组织基因表达的特征 ,共获取脂肪体组织EST 12 72 1个。经Phrap程序拼接得到 2 316个非冗余序列 ,其中包括 82 4个contigs,14 92个singletons。在鉴定出的已知基因中 ,基因表达频率有明显差异 :物质代谢相关基因表达量最高 ,占总量的 5 8 2 % ;其次为转录翻译调节相关基因和酶类基因 ,分别占 15 5 %和 14 5 %。在高量表达基因中 ,有贮藏蛋白、蛋白酶抑制剂、类IDGF蛋白、抗菌蛋白、谷胱甘肽 S转移酶等。结果表明 ,脂肪体组织基因表达的种类很多 ,特征明显 ,与脂肪体在蚕体内的贮藏功能、蛋白质合成功能、代谢调节功能以及变态发育有密切关系。     

家蚕正反交组合F1代的基因表达系列分析(SAGE)文库构建

家蚕杂交组合存在普遍的正反交遗传表型差异现象,为探讨引起正反交组合遗传差异的分子机制,构建家蚕品种75新×7532正交F1代雌雄个体和7532×75新反交F1代雌雄个体共4个基因表达系列分析(SAGE)文库。通过正反交组合同性别子代样本间的比较,显示低表达的标签在种类上占大多数,而高表达的标签在数量上占绝对优势。以错误检测率(FDR)≤0.001且拷贝数倍数差异在2倍以上作为比较样本筛选差异表达基因(DEGs)的条件,在7532×75新的雄性样本里面有298个上调基因和46个下调基因,而在雌性样本里有453个上调基因和240个下调基因。进一步对差异表达基因进行GO和KEGG路径功能分析,筛选出在显著性富集路径中的差异表达基因,其中参与新陈代谢途径、氧化磷酸化途径以及信号传导途径的差异基因在反交组合的子代中表达明显上调。     

表达序列标签在寄生虫基因研究中的应用

一个基因组的所有碱基中大约只有2％组成编码蛋白质的那部分基因，因此，测序基因组已不再是一种创建基因目录的有效途径。大量的试验证明，以cDNA的形式进行基因转录产物的大规模测序是了解基因组的首选办法。高通量cDNA测序于1991年由Adams等创始，在构建人脑的cDNA     

具有丙酮酸脱氢酶功能的家蚕Bm-l(1)基因的克隆及序列结构与表达研究

丙酮酸脱氢酶(PDH)是丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)中的前件酶,参与生成柠檬酸循环(TCA)的起始物乙酰辅酶A,决定生物体内营养成分的分配。利用电子克隆、RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法克隆了与果蝇lethal(1)G0334基因类似的具有丙酮酸脱氢酶功能的家蚕Bm-l(1)基因。Bm-l(1)基因的cDNA全长为1 630 bp,由1 200 bp的完整ORF序列、186 bp的5'-UTR和207 bp的3'-UTR组成,含8个外显子和7个内含子,编码蛋白为399个氨基酸残基,分子质量43.93kD,pI 8.07。Bm-l(1)基因编码蛋白的69-365氨基酸残基为E1-dh结构域,该结构域为硫胺素焦磷酸依赖性脱氢酶所特有。蛋白质二级结构预测结果表明α螺旋占28.8%,β折叠占12.0%。采用Clustal W进行多序列比对发现,Bm-l(1)基因编码蛋白与赤拟谷盗等昆虫的PDH具有63%以上的序列相似性,且保守区域高度一致。Bm-l(1)基因mRNA在家蚕整个卵期、幼虫期、蛹期和刚羽化的成虫中,以及5龄3 d幼虫的头部、丝腺、生殖腺、脂肪体、中肠和血液6种组织中都有较高的转录水平,且存在较小的组织差异性。     

血吸虫期别差异表达功能基因的研究进展

血吸虫的生长发育过程中,其抗原表 达呈现明显的期别差异性。利用分子生物学 技术,从期别差异表达的功能基因中筛选有 意义的功能蛋白,并深入研究它们的生物学 活性,是近年来血吸虫基因组研究的一个热 点,这对开发新的血吸虫疫苗和寻找药物靶 标,对防治血吸虫病具有重要意义。文章对 血吸虫虫卵、尾蚴、童虫、成虫各个阶段的特 点及这些阶段差异性表达的功能基因研究进 展作了综述,并简要介绍了一些在血吸虫差 异表达基因克隆中运用的生物学技术。     

家蚕小热休克蛋白基因BmHSP20.8的表达及功能研究

小热休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)是一类受热处理后诱导产生的蛋白家族。从构建的家蚕蛹cDNA文库中获得了一条全长764 bp的基因序列(GenBank登录号:AAG30944.1),其开放阅读框(ORF)长561 bp,编码186个氨基酸。用生物信息学方法对此序列进行同源性分析,表明该序列是一条保守性高达85%的家蚕小热休克蛋白20.8(BmHSP20.8),无跨膜结构,主要分布于细胞质。将该序列的ORF与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21进行原核表达,纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔获得抗血清。通过亚细胞定位技术研究BmHSP20.8在正常和热激状态下的家蚕卵巢上皮细胞Bm5和BmN中的变化,结果显示热激后BmH-SP20.8蛋白从细胞质往细胞膜方向迁移。有BmHSP20.8表达的大肠杆菌菌株经48℃处理后,其生存率比未表达BmHSP20.8蛋白的菌株高4倍左右,说明BmHSP20.8蛋白在大肠杆菌中表达能够提高细菌体在高温环境下的生存率。     

抗菌肽的基因克隆表达及其在畜牧业中的应用前景

抗菌肽是具有抗菌活性的一类短肽,具有分子量低、热稳定、广谱的抗菌、抗病毒及抑制肿瘤的生物活性,是动物防御体系的一个重要组成部分,在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用。本文主要综述了抗菌肽基因的克隆与表达的研究进展并展望了抗菌肽在畜牧业生产中的应用前景。     

RNA干扰技术和家蚕杆状病毒表达系统在纤维素酶研究中的应用前景

植物通过光合作用产生的纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。纤维素酶是糖苷水解酶的一种,能有效地将农作物秸杆等富含纤维素的物质水解为葡萄糖,进而发酵产生生物乙醇,从而解决农业、再生能源以及环境污染等问题。随着生物化学、分子生物学以及基因工程等多种交叉学科的快速发展,获得适合工业化的高活力的纤维素酶指日可待。RNA干扰是利用双链RNA特异性地降解相应序列的mRNA,从而特异性地阻断相应基因的表达,是后基因组时代的一种强有力的调控目的基因表达的实验工具。家蚕杆状病毒表达系统是一种快速、高效表达外源基因的技术手段,目前该系统的发展和应用已经非常成熟。本文综述了纤维素酶的特性以及近年来国内外对纤维素酶、RNA干扰和家蚕杆状病毒表达系统的研究进展,并对该两种实验技术手段在今后纤维素酶研究中的应用前景作了预测和展望。     

应用重组家蚕核多角体病毒在蚕体中表达人丙型肝炎病毒C区及E1区基因

将人丙型肝炎病毒的C区、E1区及部分E2区基因装入转移载体 pBM0 3 0 ,经原位杂交筛选、酶切鉴定、Southern杂交检测确定转移质粒装载成功。将转移质粒与家蚕核多角体病毒重组 ,在家蚕BmN细胞中挑选重组病毒 ,经点杂交技术确证重组病毒带有目的基因。将重组家蚕核多角体病毒通过针刺和注射方法感染蚕蛹及 5龄期家蚕 ,肽抑制试验检测目的基因表达的多肽活性。结果表明 ,目的基因已得到表达 ,表达量较高 ,为每蛹体约 60～ 60 0 μg。     

滞育诱导发生温度与光周期对家蚕垂体同源框激素基因Pitx表达的影响

家蚕垂体同源框激素PITX对滞育激素DH的分泌与作用有直接影响。为了探讨家蚕滞育的信号传导机制,研究了3种典型的滞育发生诱导温度和光周期条件对Pitx基因表达的影响。结果显示,亲代催青期滞育卵诱导发生条件25LL显著上调了蚕卵中Pitx基因表达水平。整个世代持续25LL环境中,3龄前幼虫和成虫体内,Pitx基因的表达水平高于15DD环境中的蚕体;胚后蚕体Pitx基因的表达水平有显著组织差异,幼虫眠中表达水平有下调趋势。子代卵内Pitx基因mRNA的水平变化与亲代诱导所致的蚕卵滞育性差异密切相关,滞育性卵中未检测到母源Pitx基因的mRNA,卵龄12～24h的胚胎发生期则有较高水平的表达,卵龄72h后的滞育发生阶段后只有痕迹量;非滞育性卵中有较高水平的母源Pitx基因mRNA,胚胎发生及发育期,Pitx基因转录水平显著高于滞育性卵;亲代20LD催青条件下所产卵滞育性不稳定,Pitx基因的mRNA水平显著高于滞育性卵,也高于非滞育性卵。亲代卵的孵化温度与光周期决定子代卵的滞育性,也影响到Pitx基因表达水平,子代卵内Pitx基因表达水平高低不是蚕卵滞育与否的关键。     

家蚕触角富集UDP葡萄糖醛酸基转移酶基因的克隆与表达分析

糖基化作用在抑制和排除一系列内生和外源化合物的毒性方面起重要作用,一系列尿苷二磷酸-糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases,UGTs)参与了糖基化反应过程。为了解家蚕中的UDP葡萄糖醛酸基转移酶的生理作用,克隆和表达了家蚕触角富集UDP葡萄糖醛酸基转移酶基因BmUGT013829。BmUGT013829基因cDNA全长1 545 bp,编码蛋白含有514个氨基酸残基。Western blotting检测发现BmUGT013829在家蚕脂肪体、头部、体壁和中肠组织中表达,在中肠组织的表达量低,在头部高量表达。免疫组织化学试验结果显示,BmUGT013829在头部的触角中表达水平最高。研究结果表明,BmUGT013829是一种触角富集尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶,推测其在嗅觉中扮演着重要角色。     

蚕沙的药理研究及临床应用研究进展

蚕沙既是蚕桑副产物,也是我国传统中药之一,具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化等一系列作用。本文对其药理作用及临床应用的国内外研究进展进行了综述,为其进一步研究和开发利用提供了参考。     

生长激素受体基因表达的研究进展

生长激素(growth hormone,GH)在促进动物生长、发育等代谢过程中起着重要作用。长期以来人们在研究动物生长发育机制及其调控时,主要着眼于提高生长激素水平。然而GH必须与靶器官上生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)结合,由GHR介导将信号传入细胞内才能发挥作用。大量研究结果显示,动物生长速度与GH水平并不完全平行,但与肝脏GHR呈明显正相关。生长快的肉鸡血液中GH和垂体GH mRNA水平比生长慢的蛋鸡低,而肝脏GHR水平比蛋鸡高;患侏儒症动物血液中GH浓度却比正常动物高,而GHR胞外部分缺失或功能不全。可见GHR基因表达对动物生长发育调控起着至关重要的作用。