哺乳动物ES细胞与EG细胞研究进展

综述了国内外对哺乳动物ES细胞和EG细胞的研究概况, 并着重讨论了近年来国内对于ES/EG细胞的饲养层制备、诱导分化、种系嵌合与成纤维细胞的冷冻保存等方面的研究进展.探讨了ES细胞与EG细胞的共同特征及其起源的差异,指出EG细胞与ES细胞相比,具有培养材料易获得、存在时间长、无种间差异等优点.     

Histocompatible embryonic stem cells by parthenogenesis

Genetically matched pluripotent embryonic stem (ES) cells generated via nuclear transfer or parthenogenesis (pES cells) are a potential source of histocompatible cells and tissues for transplantation. After parthenogenetic activation of murine oocytes and interruption of meiosis I or II, we isolated and genotyped pES cells and characterized those that carried the full complement of major histocompatibility complex (MHC) antigens of the oocyte donor. Differentiated tissues from these pES cells engrafted in immunocompetent MHC-matched mouse recipients, demonstrating that selected pES cells can serve as a source of histocompatible tissues for transplantation.     

Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells

Continuation of mammalian species requires the formation and development of the sexually dimorphic germ cells. Cultured embryonic stem cells are generally considered pluripotent rather than totipotent because of the failure to detect germline cells under differentiating conditions. Here we show that mouse embryonic stem cells in culture can develop into oogonia that enter meiosis, recruit adjacent cells to form follicle-like structures, and later develop into blastocysts. Oogenesis in culture should contribute to various areas, including nuclear transfer and manipulation of the germ line, and advance studies on fertility treatment and germ and somatic cell interaction and differentiation.     

胚胎干细胞的分离克隆

从全能性或多能性细胞获取、分化抑制物选择、培养基、分离方法、鉴定、保存等６个方面，对胚胎干细胞的分离培养体系的建立进行了系统综述。     

兔胚胎干细胞核移植克隆技术

对兔胚胎干细胞核移植过程中受体卵子的去核方法、供核兔胚胎干细胞的预处理及电融合的场强等操作技术进行了比较试验.结果表明,压迫式去核方法的去核有效率达85.71%,略高于注吸式.当电融合场强为1.6或1.8 kV/cm时,重组胚的卵裂率和桑、囊胚率较高,分别达到33.3%和16.67%.在操作液中添加PVA对獭兔干细胞核转入融合与后期囊胚发育均有不同程度的影响,使囊胚发育率显著提高.将11个融合胚及5枚发育囊胚移植到受体兔体内,未发现妊娠现象.     

人类胚胎干细胞研究述评

对人类胚胎干细胞(hESCs)的来源、培养方法、建系条件、生物学特性和鉴定方法、遗传操作及其需解决的问题进行了讨论。提出目前研究的重点在于揭示维持ES细胞多能性和自我更新的机理,进一步优化人类和其他哺乳动物类ES细胞的分离、培养、建系方法,探讨其定向分化机理,建立胚胎干细胞(ESCs)和胚胎生殖细胞(EGCs)的大规模快速扩增技术;完善hESCs向重要功能细胞(生殖细胞)分化的体系;单细胞比对分析ESCs、畸胎瘤细胞(ECSs)、EGCs、类胚体(EBs)、各级生殖细胞和成体细胞的基因及蛋白表达图谱,以探求生殖细胞、成体细胞、ESCs、ECSs、EGCs的本质区别,积极开展将ES细胞用于治疗人类疾病模型的研究。     

胚胎干细胞诱导分化研究进展

哺乳动物胚胎干细胞一般可从胚胎囊胚内细胞团分离得到 ,具有在体外保持不分化的无限增殖能力 ,在合适的培养条件下 ,胚胎干细胞可定向诱导分化形成多种细胞类型。人们对胚胎干细胞进行体外培养与定向分化可以得到大量同源细胞 ,以应用于患疾病的细胞或器官移植治疗等研究。文章概述了胚胎干细胞增殖与分化的信号调节机制、诱导分化方法 ,国内外研究概况及展望 4个方面的内容     

Patient-specific embryonic stem cells derived from human SCNT blastocysts

Patient-specific, immune-matched human embryonic stem cells (hESCs) are anticipated to be of great biomedical importance for studies of disease and development and to advance clinical deliberations regarding stem cell transplantation. Eleven hESC lines were established by somatic cell nuclear transfer (SCNT) of skin cells from patients with disease or injury into donated oocytes. These lines, nuclear transfer (NT)-hESCs, grown on human feeders from the same NT donor or from genetically unrelated individuals, were established at high rates, regardless of NT donor sex or age. NT-hESCs were pluripotent, chromosomally normal, and matched the NT patient's DNA. The major histocompatibility complex identity of each NT-hESC when compared to the patient's own showed immunological compatibility, which is important for eventual transplantation. With the generation of these NT-hESCs, evaluations of genetic and epigenetic stability can be made. Additional work remains to be done regarding the development of reliable directed differentiation and the elimination of remaining animal components. Before clinical use of these cells can occur, preclinical evidence is required to prove that transplantation of differentiated NT-hESCs can be safe, effective, and tolerated.     

山羊类胚胎干细胞的分离、克隆研究

从胚胎发育阶段、饲养层、生长因子等方面对影响山羊胚胎干细胞的分离、克隆的因素进行了研究。结果表明：囊胚期可作为分离山羊胚胎干细胞收集胚胎适宜阶段；小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和山羊胚胎成纤维细胞(GEF)对山羊类ES细胞分离效果影响不明显；生长因子LIF和SCF配合使用可分离到山羊的类ES细胞，并传至第4代。     

小鼠胚胎干细胞转染条件的优化

【目的】对小鼠胚胎干细胞(mESCs)转染条件进行优化。【方法】分别将0.5×105,1×105,2×105,4×105个细胞接种24孔板(各细胞量均接种2孔),培养48h在其细胞融合度分别为30%,50%,70%,90%左右时,分别设置相同的(0.8μgDNA/2μL脂质体)和不同的DNA/脂质体用量(DNA量(μg)/Lipo量(μL)分别为0.4/1,0.8/2,1.6/4,3.2/8),采用脂质体(LipofectamineTM2000)转染法,将pEGFP-N1报告基因载体转染到mESCs中,48h后通过荧光观察和流式分析检测各组EGFP荧光强度,比较转染效率。【结果】在质粒及脂质体用量相同(0.8μgDNA/2.0μL脂质体)的条件下,随着细胞融合度的增加,EGFP荧光强度逐渐减弱,在细胞融合度为30%,50%,70%,90%左右时转染,各组EGFP阳性细胞率分别为56.4%,51.8%,40.8%和23.3%。提高转染质粒及脂质体量可在一定程度上提高转染效率,但脂质体的细胞毒性也随之增加,不利于细胞生长。【结论】低融合度(30%～50%)条件下,使用0.8μgDNA/2.0μL脂质体对mESCs进行转染,可获得较高的转染效率(50%),同时可维持良好的细胞状态。     

鸡胚胎干细胞单细胞克隆制备方法的比较

提取鸡X期胚盘细胞,体外培养传至第3代,采用口吸管法、细胞稀释法及克隆环法将细胞集落分离成单个细胞,并将其接种至96孔板上,每孔1个细胞,采用细胞化学法和免疫荧光法检测细胞表面标志物,探讨鸡胚胎干细胞单细胞克隆制备的实际操作的可行性,并对其生物学特性进行鉴定.结果表明:口吸管法、克隆环法、细胞稀释法克隆率分别为0、1.0%、4.2%.3种方法相比较,细胞稀释法具有操作简单易行、实验时间短、对细胞伤害小等优点,经碱性磷酸酶活性和阶段特异性表面抗原1免疫荧光鉴定均呈阳性,扩增出的克隆能稳定增殖且不分化.     

人胚胎干细胞不同冷冻保存方法的比较

【目的】比较人胚胎干细胞不同冷冻保存方法的复苏率,建立高效的冷冻保存方法。【方法】利用慢速冷冻、开放式和密闭式玻璃化冷冻3种方法保存人胚胎干细胞克隆,比较这3种方法的复苏效率,并通过免疫组化染色检测复苏后细胞的OCT-4表达。【结果】开放式快速冷冻方法的克隆复苏率为(97.5±5.0)%,密闭式快速冷冻方法的克隆复苏率为(96.7±5.8)%,均极显著高于慢速冻存方法(25.7±4.1)%。解冻后的胚胎干细胞克隆仍然保持胚胎干细胞的特性。【结论】开放式和密闭式玻璃化冻存方法能够高效保存人胚胎干细胞。     

人类胚胎干细胞与小鼠囊胚嵌合的探讨

【目的】探讨人类胚胎干细胞(Human embryonic stemcells,hESCs)能否在小鼠胚胎环境中生存并参与其各个组织器官的分化,为hESCs与小鼠囊胚嵌合的可行性研究提供依据。【方法】将154枚受精后3.5 d(3.5days postcoitum,3.5 dpc)ICR品系小鼠囊胚随机分为3组:试验组(注射hESCs)、模拟注射组(注射针仅刺破透明带及滋养层细胞,但不注射细胞和溶液)及对照组(未注射),于注射后培养24 h统计囊胚完全孵化率。将稳定转染增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的含有9~15个hESCs的小细胞团块,显微注射入3.5 dpcICR品系小鼠囊胚腔内,注射后分别于3,24,48,69,77,94和116 h,在普通荧光显微镜下观察EGFP阳性细胞的定位与动态分布情况,并将嵌合体胚胎移植入假孕母鼠子宫内,分别于移植后第4天和第6天处死孕鼠,普通荧光显微镜下观察EGFP阳性细胞在整个小鼠胚胎中的分布情况。【结果】注射后24 h,试验组和模拟注射组的囊胚完全孵化率分别为73.6%和77.1%,均极显著高于对照组(38.3%)(P<0.01),有88.9%(32/36)的胚胎中的hESCs迁移并定位在小鼠内细胞团(ICM)及其临近的滋养层细胞上;体外培养48 h后,EGFP阳性细胞数进一步减少;116 h后,只有1枚胚胎仍残留3~4个EGFP阳性细胞,且散在分布于ICM克隆之外。体内发育试验结果显示,将43枚注射后的嵌合体囊胚移植入6只代孕母鼠子宫内,获得了22枚脱膜,有17枚脱膜中含有胚胎,其中形态正常胎儿14枚,没有胚胎含有EGFP阳性细胞。【结论】hESCs很难与小鼠囊胚正常嵌合。