分子标记辅助选育小麦抗白粉病、优质高分子量麦谷蛋白亚基聚合体

现代小麦育种的目标是选育丰产、综合抗逆性好的优质小麦新品种,将分子标记技术与传统育种方法相结合可以大大提高育种效率.本研究利用与小麦抗白粉病基因Pm21紧密连锁的共显性PCR标记、以及优质高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5 1Dy10特异的PCR标记对以小麦品种安农94212、安农92484为优质亲本和以抗白粉病小麦簇毛麦易位系为抗病亲本的杂交高代材料进行标记位点的检测,结合田间抗病性鉴定结果,筛选、培育出聚合有Pm21和1Dx5 1Dy10的抗白粉病小麦聚合体,为小麦抗病、优质育种提供了具有重要利用价值的中间材料.     

小麦回交后代中1 Dx 5+1 Dy 10优质亚基的分子检测

利用高分子量麦谷蛋白亚基1 Dx5、1 Dy 10的PCR分子标记,对贵农21与加拿大小麦Neepawa的BC1F2 100个单株进行了分子标记辅助选择.结果表明,具有1 Dx5和1 Dy 10亚基的亲本Neepawa和BC1F2代单株中可扩增出1 Dx5(450 bp)和1 Dy 10(576 bp)特异带,具有12亚基的单株扩增出612 bp特异带;在100个单株个体中,共检测到具有5+10优质亚基的5株,占5%;有2+12亚基的34株,占34%;同时具有5+10和2+12亚基的4株,占4%;并发现了新的组合类型5+12亚基,占57%.利用分子标记辅助选择技术,结合回交选育,可以在较早世代鉴定小麦优质亚基组合,选育出具有亚基组合新类型的小麦优质品系,为小麦的优质育种快速提供选育材料,从而提高选择效率,加快育种进程.     

小麦胚乳贮藏蛋白高分子量谷蛋白亚基1Dy10单克隆抗体在品质育种中的应用——Ⅱ.胚乳贮藏蛋白HMW-GS1Dx5 1Dy10的鉴别

本文研究了利用免疫化学方法鉴别小麦胚乳贮藏蛋白高分子量谷蛋白亚基1Dx5 1Dy10的可能性。结果表明:1Dx5 1Dy10和1Dx2 1Dy12亚基与单克隆抗体的反应不同,利用特异性单克隆抗体可以鉴别小麦胚乳贮藏蛋白中是否含有1Dx5 1Dy10亚基,鉴别的准确度受抗体种类、抗体浓度及包被蛋白浓度的影响;HMW-GS在F_1籽粒中表现为倾母遗传。免疫化学测定法具有快速、简单、准确、所需样品少等特点,可用于育种早代的辅助选择。     

小麦胚乳贮藏蛋白高分子量谷蛋白亚基1Dy10单克隆抗体在品质育种中的应用——Ⅰ.间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)的建立

本文研究利用高分子量谷蛋白亚基1Dy10特异性单克隆抗体测定小麦胚乳贮藏蛋白中是否含有优质亚基1Dx5 1Dy10的免疫化学测定条件,建立适宜的间接ELISA测定法。结果表明:蛋白质提取剂种类对籽粒贮藏蛋白提取效率及1Dx5 1Dy10与1Dx2 1Dy12亚基的识别起决定作用。其中以10mMHCl较理想,还原剂DTT能提高1Dx5 1Dy10与1Dx2 1Dy12亚基的识别能力,蛋白提取时间、醇溶蛋白含量以及封闭液的种类都对实验结果具有重要影响。     

1Dx5亚基特异PCR标记在小麦品质性状群体改良中的应用

利用1Dx5亚基特异PCR标记对改良品质性状的Ta1小麦轮回选择群体C₄进行了分子检测，并通过SDS-PAGE电泳对其结果的验证，以探讨群体5亚基基因型的组成及其特异PCR标记用于轮回选择的可行性。结果表明：（1）1Dx5亚基特异PCR标记在具有1Dx5亚基的单株中均扩增出450 bp的基因片段，生化标记检测也证明所有能扩增出450 bp片段的单株均含有5亚基的条带，分子标记与生化标记结果一致，而且PCR扩增结果的重复性好。说明1Dx5亚基特异PCR标记的选择准确率高，完全可用于Ta1小麦群体改良中1Dx5亚基基因型的检测；（2）构建的轮回选择群体C₄中携带1Dx5亚基的优质基因型比例高，达56.81％，且大都伴随与之连锁的10亚基出现。生化检测表明群体中同时产生5＋12稀有亚基和14＋15与5＋10的聚合体。     

黄淮麦区部分小麦品种（系）1Dx5+1Dy10的分子检测与分析

目前在已报道的检测高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5的PCR分子标记中,由引物Dx-F,Dx5-F和Dx-R组成的共显性标记,能稳定地扩增出5亚基和非5亚基的特异序列,并且无非特异PCR产物,是用于高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5分子检测的最理想标记。本次实验利用此对引物, 通过PCR技术对221份小麦亲本进行了1Dx5亚基检测。结果表明,在所检测的材料中有35份材料携带1Dx5亚基,占所测材料总数的16.3%,远低于国外的基因频率（约85%）。     

1Dx5在新冬26小麦中的遗传转化及分析

为了对转1Dx5基因小麦的T1进行遗传分析,将优质高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)基因1Dx5转入新疆耐盐小麦品种新冬26,在蛋白质水平上经SDS-PAGE检测,有37粒小麦种子1Dx5基因表达。经过继代培育,得到37个T1转基因株系,SDS-PAGE分析T1转基因小麦籽粒的HMW-GS组成,结果表明:在蛋白质水平,HMW-GS的组成在T1小麦种子中有3种表型:表型Ⅰ,外源1Dx5基因没有表达;表型Ⅱ,外源1Dx5基因表达;表型Ⅲ,内源1Dx2基因没有表达。这3种表型出现的概率分别约为34.3%,45.9%和19.8%。该研究成功获得了新的HMW-GS组成的小麦,为选育优质小麦提供分子依据。     

新疆小麦品种高分子量谷蛋白亚基及相关品质基因的分子标记检测

高分子量麦谷蛋白亚基、1B·1R易位系、多酚氧化酶(PPO)活性及黄色素含量等基因对小麦加工品质有重要影响,准确、快速鉴定这些基因对品质改良有重要意义.本研究对新疆当地及国内外引进的321份小麦品种进行SDS-PAGE分析,利用特异性分子标记对高分子量谷蛋白亚基中的Dx5、Bx7、By8、By9亚基、1B·1R易位系、PPO和黄色素含量基因进行鉴定.进一步验证分子标记检测的可靠性和准确性,为优质小麦分子标记辅助育种提供材料和方法.SDS-PAGE分析表明,供试材料有21种亚基类型,其中Glu-A1位点有3种类型,以null为主;Glu-B1位点有10种类型,Bx7+By8和Bx7+By9亚基占主导地位;Glu-DJ位点有8种类型,Dx2+Dy12和Dx5+Dy10占主导地位.分子标记检测表明,Dx5亚基的频率为38.3%,Bx7亚基的频率为85.7%,By8亚基的频率为38.9%,Bx9亚基的频率为42.7%;特异性PCR标记扩增与SDS-PAGE鉴定结果的吻合率分别为97.2%、98.4%、93.4%和97.2%.在新疆当地品种、其他国内品种和国外品种中,1B·1R易位系材料的频率分别为22.0%、31.5%和25.0%,Psy-A1b的频率分别为9.0%、10.8%和5.4%,Ppo-A1b的频率分别为38.0%、43.8%和45.7%,Ppo-Dla的频率分别为48.0%、66.9%和40.2%.同时含Ppo-A1b和Ppo-D1a的材料有74份,占23.0%.本试验中采用的基因特异性标记重复性好、准确率高,可有效用于小麦品质分子标记辅助选择.     

小麦高分子量谷蛋白亚基功能的体外鉴定

通过SDS-PAGE方法回收纯化小麦高分子量谷蛋白亚基1Ax1、1Dx5、1Dy10、1Bx7、1By8和1By9,然后利用微量配粉方法将单个亚基分别添加到对照“京411”面粉中,经过揉混仪分析单个亚基对揉面特性的影响,进而确定各个亚基的功能特性。根据揉面时间、稳定时间等参数的变化,6个小麦高分子量谷蛋白亚基对面粉品质的影响表现为1Dy10 > 1Ax1 > 1Dx5 > 1By8 > 1Bx7 > 1By9。研究结果表明,通过揉混仪进行体外配粉检测是快速鉴定高分子量谷蛋白亚基功能的一种有效方法。     

农杆菌转化小麦幼胚获得转bar基因再生植株

用农杆菌转化小麦授粉10d后的幼胚，经5‰PPT筛选获得大量正常再生植株。PCR及PCR－Southern杂交检测证明其中23％（18株）再生苗为转化bar基因植株，这些植株可明显提高对basta的抗性。还总结了农杆菌转化小麦幼胚高效获得转基因再生植株的处理程序。     

利用SDS-PAGE鉴定转基因小麦HMW-GS的表达类型和后代遗传

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在蛋白质水平上对T2～T5代小麦转基因株系高分子量谷蛋白亚基(HMW—GS)的遗传表达及其分离进行了鉴定和分析。结果发现，外源1Dx5和1Dy10基因在T2代部分株系中表达；在有的株系中出现了原亚基(8亚基)的缺失或沉默和新亚基(暂定8^*)的产生，因而检测出2 5 10 12，2 5 7 8^* 10 12，5 7 10，2 7 10 12的多种类型。对2 5 10 12型株系进行了多代跟踪分析，发现其在T2～T5代陆续发生分离，存在于不同单株、不同单穗的子粒和同一单粒后代之间。经筛选，获得了天然不存在的亚基类型为2 5 10 12，2 10 12，2 5 12等稳定表达的种质创新株系。     

转基因小麦外源品质基因1Dx5表达的遗传研究

转基因小麦B72-8-11b中外源品质基因1Dx5表达量是内源相应基因表达量的6倍。利用小麦转基因品系为父本，常规品种鄂麦12、鄂麦18和日喀则8号分别为母本，配置3个杂交组合。采用SDS—PAGE技术，检测各组合亲本、F1、F2代的HMW-GS组成，研究转基因小麦B72-8-11b中外源品质基因1Dx5表达的遗传。结果表明：外源1Dx5基因有功能拷贝整合在1个位点，如同内源品质基因，遵从孟德尔遗传模式。这对育种选择策略的制订具有指导意义，也表明了基因枪转化法能够使得外源基因有功能拷贝整合在1个位点并能稳定传递。     

Allelic variation and composition of HMW-GS in advanced lines derived from d-genome synthetic hexaploid / bread wheat (<Emphasis Type="Italic">Triticum aestivum</Emphasis> L.)

The objective of this study was to identify allelic variations at Glu-1 loci of wheat (Triticum aestivum L.) advanced lines derived from hybridization of bread wheat and synthetic hexaploid wheats (2n = 6x = 42; AABBDD). Locally adapted wheat genotypes were crossed with synthetic hexaploid wheats. From the 134 different cross combinations made, 202 F₈ advanced lines were selected and their HMW-GS composition was studied using SDS-PAGE. In total, 24 allelic variants and 68 HMW-GS combinations were observed at Glu-A1, Glu-B1, and Glu-D1 loci. In bread wheat, the Glu-D1 locus is usually characterized by subunits 1Dx2+1Dy12 and 1Dx5+1Dy10 with the latter having a stronger effect on bread-making quality. The subunit 1Dx5+1Dy10 was predominantly observed in these advanced lines. The inferior subunit 1Dx2+1Dy12, predominant in adapted wheat germplasm showed a comparative low frequency in the derived advanced breeding lines. Its successful replacement is due to the other better allelic variants at the Glu-D1 locus inherited in these synthetic hexaploid wheats from Aegilops tauschii (2n = 2x = 14; DD).     

Allelic variation and genetic diversity of high molecular weight glutenin subunit in Chinese endemic wheats (Triticum aestivum L.)

The high molecular weight glutenin subunit (HMW-GS) compositions of 66 Chinese endemic wheats were determined by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Ten alleles at the Glu-1 loci were detected in 50 Tibetan weedrace wheat accessions which in combination resulted in seven different HMW-GS patterns. Four HMW-GS patterns were observed among 10 Yunnan hulled wheat accessions, and two patterns in six Xingjiang rice wheat accessions. Two novel alleles (Bx7** + By8, Bx7 + By8**) and two rare alleles (Dx2 + 1Dy12*, Dx2 + null) were found in Tibetan weedrace accessions, with one of the latter (Dx2 + Dy12*) also being found in Yunnan hulled wheat. The mean indices of genetic variation at the Glu-1 loci in Yunnan hulled wheat, Tibetan weedrace wheat and Xingjiang rice wheat were 0.2232, 0.1655 and 0.0926, respectively, showing that Yunnan hulled wheat and Tibetan weedrace wheat had higher genetic variation than Xingjiang rice wheat.     

小麦品系2004s-47的1Dx基因的克隆与序列分析

明确 2004s-47品系 1Dx基因的序列,为寻找新的优质 HMW-GS类型、实现小麦品质的改良及育种提供理论依据。应用 SDS-PAGE对 2004s-47品系中 HMW-GS的亚基组成进行分析,用 PCR技术克隆1Dx亚基基因并用 DNAMAN软件进行序列分析。结果从 2004s-47品系中扩增出了大小为 2514 bp的基因。该基因具有典型的小麦 HMW-GS x-型基因序列结构特征。又因为 1D比 1A和 1B基因组中的 x-型和 y-型基因易表达,结合 SDS-PAGE的结果,所以 2004s-47品系中 HMW-GS的亚基组成为(Null, 7+8, ?+10)。序列比对表明, 2004s-47品系的 1Dx？基因与节节麦(Aegilops tauschii) 1Dx2.1t (AF480486)同源性最高。将该序列提交到 NCBI,获得序列登陆号为： KP702118。2004s-47品系中 1Dx？序列的确定,为原核表达确定1Dx？是否为新的基因提供了基础,也为品质改良及育种提供了依据。     

小麦优质谷蛋白亚基分子标记多重PCR体系的建立与应用

Ax1/Ax2*、Dx5和过量表达的Bx7亚基(Bx7^OE)被认为是对小麦品质有正向效应的优质亚基。根据以上亚基特异性分子标记建立相应的多重PCR体系,经品种和群体检验,证明利用该体系鉴定亚基的结果稳定可靠、成本较低。利用该多重PCR技术对89份西藏小麦育成和推广品种(系)的优质亚基频率进行鉴定,结果表明, Dx5和Ax1/Ax2*亚基的频率均为12.4%,没有检测到Bx7^OE,同时携带两个优质亚基的材料频率为10.1%,该麦区品质育种必须加强优质亚基的引入。针对优质亚基Ax1/Ax2*、Dx5和Bx7^OE的多重PCR体系,为小麦品质育种亲本评价和通过杂交方法聚合优质亚基基因提供了一种实用可靠的标记辅助选择技术。