大肠杆菌K99和F41菌毛抗原的不同缓冲液热处理提取方法比较的研究

本试验用Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液（Ｔ）、ＰＢＳ缓冲液（Ｐ）、生理盐水（Ｓ）和２Ｍ尿素ＰＢＳ缓冲液（Ｕ）以热处理的方法提取大肠杆菌Ｋ９９和Ｆ４１菌毛抗原,并用硫酸铵盐析纯化Ｋ９９以及用１Ｎ醋酸滴定和氯化镁沉淀分别纯化Ｆ４１。根据ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和蛋白质含量测定结果,四种缓冲液对Ｋ９９的提取量依次是Ｕ＞Ｓ＞Ｐ,而Ｔ检不出Ｋ９９;对Ｆ４１的提取量依次是Ｕ＞Ｔ＞Ｐ＞Ｓ。Ｋ９９纯化后取得了满意的纯化结果,Ｆ４１纯化后大量上样做电泳时仍有微细的污染带出现,而且氯化镁沉淀后造成Ｆ４１严重损失。Ｋ９９和Ｆ４１纯化前后的各个样品经超声波处理、０．５％脱氧胆酸钠处理和未处理的原液与自家因子血清做琼扩试验以及Ｋ９９和Ｆ４１做交叉琼扩试验,均具有良好的特异性,而且以超声波处理后的样品做琼扩试验效果最佳。     

用大肠杆菌K99和F41菌毛抗原检测牛血清抗体的琼脂扩散试验的研究

用含２ｍｏｌ／Ｌ尿素的磷酸盐缓冲液以热处理方法提取的Ｋ９９和Ｆ４１菌毛作为抗原,对琼脂扩散试验方法进行研究。结果表明本试验方法简便,特异性强,敏感性高,可用于血清抗体检测;所制备的抗原稳定、重复性好。     

猪K88、K99、987P、F41埃希氏大肠杆菌高密度发酵培养技术的初步探讨

采用高密度发酵和普通深层通气两种方法培养含K88、K99、987P、F41菌毛抗原的四株猪埃希氏大肠杆菌,对其培养液进行活菌数、OD值、pH值、效价的测定。实验结果表明,运用高密度发酵方法培养,各菌活菌数可达4.1×1010~4.9×1010CFU/mL,效价为211~213;运用普通深层通气方法培养,各菌活菌数为0.51×1010~0.59×1010CFU/mL,效价为24~25,可选择高密度发酵方法替代普通深层通气方法培养,用于制备猪埃希氏大肠杆菌K88、K99、987P、F41四价菌毛提纯苗。     

羔羊大肠杆菌K_(99)F_(41)双价基因工程苗应用效果观察

羔羊是严重危害畜牧业生产的一种高发病。根据对新疆兵团十三个师（局）1995年的疫情调查统计,全兵团羔羊发病16．64万只,发病率14．80％;死亡9．11万只,死亡率8．10％,该病目前是危害养羊生产的重点疫病。为了探讨基因工程苗防治该病的可行性,我们进行了羔羊大肠杆...     

大肠杆菌K99菌毛抗原的制备及其免疫抗体效价的测定

肠毒素型大肠杆菌 (Enterotoxigenic E.coli,ETEC)是幼龄动物 (仔猪、犊牛、羔羊等 )腹泻中常见而且重要的致病菌之一 ,此类大肠杆菌能借助于其所产生的菌毛抗原粘附于动物的小肠黏膜上 ,定居并产生肠毒素 ,从而呈现出致病作用。当大肠杆菌 K99菌毛粘附于绵羊红细胞上时 ,能使红细胞发生凝集 ,且不被 D-甘露糖抑制 ,系一种甘露糖低抗血凝反应 (MRHA) ,菌毛的MRHA可被相应的抗体抑制 ,故又可用甘露糖抵抗血凝抑制反应 (MRHI)来对其作出确诊[1] 。目前在各种动物中已发现并展开研究的大肠杆菌菌毛抗原主要有 :K88(F4)、K99(F5)、987…     

F1菌毛抗原在致病性大肠杆菌实验感染鸡体内的定殖和表述

导致鸡发生败血症的大肠杆菌一般具有Ｆ１（Ｉ型）菌毛（由Ｐｉｌ同源基因群编码）和／或Ｐ菌毛（由ｐａｐ同源基因群编码），这些菌毛通常被认为与感染和定殖有关。本实验以３株致病大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１（Ｐｉｌ＾＋／ｐａｐ＾＋）、Ｏ２（ｐｉｌ＾＋／ｐａｐ）和Ｏ７８（ｐｉｌ＾＋／ｐａｐ＾＋）通过气管内注射１．５周龄鸡，旨在探讨由不同毒力因子引起传染的动力学变化及其菌毛在体内的表述，感染后３～１４４小时剖检     

大肠杆菌的一种新型菌毛抗原（F1987）

从腹泻死亡貉病例中分离到２株（Ｎｏ１,Ｎｏ２）能产生一种新型菌毛抗原（暂定名：Ｆ１９８７）的大肠杆菌。该新型菌毛在菌体上生长致密、长短不一,直径为３．６３６ｎｍ,同时有性菌毛形成（直径４．２ｎｍ）。该菌毛在Ｍｉｎｃａ培养基上３７℃培养能良好表达,具有能稳定地凝集人及貂红细胞的特定血凝谱,血凝作用可被相应抗血清所抑制。菌毛蛋白质的分子量为１９１００,等电点为３．０,含有天门冬氨酸等１６种氨基酸。用凝集反应、沉淀反应、标记抗体技术等血清学反应能有效地检验该新型菌毛抗原。产生该新型菌毛抗原相应菌株的菌体抗原为Ｏ２３群,能产生肠毒素,人工感染能引起本动物貉发病。     

大肠杆菌菌毛抗原K99与耐热肠毒素STⅠ融合基因的克隆与核苷酸序列测定

采用PCR技术，从大肠杆菌K99中扩增出0．54kb的K99菌毛抗原基因，然后将其克隆到pUCm—T载体上，用Bgl Ⅱ鉴定K99插入的方向并测序。选择目的基因片段插入方向正确的重组质粒经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切后，通过T4连接酶与同样经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切合成的耐热肠毒素ST Ⅰ核苷酸序列连接，通过PCR方法鉴定分析和核苷酸序列测序分析，证明插入的K99-ST Ⅰ融合基因片段具有正确的核苷酸序列。     

K88、K99、987P仔猪大肠杆菌菌种的提纯和保存

由产肠毒素性大肠杆菌感染而引起的仔猪急性下痢分布十分广泛,本病主要危害一月龄以内的新生仔猪,尤其是一周龄以内的仔猪发病率和死亡率最高,多以急性、水样腹泻为特性。随着大型集约化养殖业的发展,病原性大肠杆菌对畜牧业所造成的损害已日益明显。产肠毒素性大肠杆菌含K88、     

牛产肠毒素大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立

通过多重PCR扩增产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigentic E.coli，ETEC）的毒力因子F41菌毛、K99菌毛和STa肠毒素的编码基因来检测和鉴定ETEC。试验中对影响PCR扩增的dNTP、Mg^2＋、引物浓度以及退火温度等因素进行优化，在优化条件的基础上，确定多重PCR的特异性和灵敏性，以此建立同时检测ETEC多个毒力因子的多重PCR方法。用该方法对分离于犊牛腹泻和犊牛肠毒血症的7株大肠杆菌进行检测，结果2株为F41、K99和STa阳性，4株为F41、STa阳性，1株为K99STa阳性。这与玻片凝集试验检测菌毛的结果一致。试验表明，该方法特异性强、敏感性高、简便、快速，适用于临床鉴定和检测牛ETEC菌株。     

产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛蛋白抗原基因的克隆与表达

应用PCR从产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）中扩增出不含信号肽序列的K99菌毛蛋白基因片段，克隆测序后，将该片段连接到E.coli表达载体pET28a( )中，转化E.coli表达菌株BL21（DE3），筛选得到可诱导表达K99抗原的工程菌株。经IPTG诱导，分离纯化K99重组蛋白，以其免疫新西兰大白兔，获得重组蛋白的兔抗血清；免疫印迹分析表明，此重组蛋白制备的抗血清能与标准的K99强毒株姓明显的抗原抗体反应。     

重组大肠杆菌K88ab和K99蛋白制备的鸡卵黄抗体的效力评价

为探索以重组大肠杆菌K88ab和K99蛋白为免疫原制备鸡卵黄抗体的可行性,本研究利用基因工程技术,在大肠杆菌中高效表达重组K88ab和K99蛋白。分别以重组蛋白和提取的天然菌毛为免疫原制备抗K88ab和K99菌毛的鸡卵黄抗体,并对抗体效价、特异性以及抗体的预防和治疗效果进行了检测和比较。试管凝集反应结果显示,以重组蛋白为免疫原制备的鸡卵黄抗体效价最高可达1∶2 560,与用天然菌毛为免疫原制备的鸡卵黄抗体的效价基本一致。该抗体分别与K88ab+和K99+大肠杆菌发生特异性凝集,并能分别有效抑制K88ab+和K99+大肠杆菌对新生仔猪肠上皮细胞的吸附。临床应用结果显示,本实验制备的卵黄抗体对仔猪黄痢和仔猪白痢的预防有效率为100%,保护率为91%;治疗有效率为100%,治愈率为87%。实验结果表明该卵黄抗体对仔猪黄痢和仔猪白痢具有良好的预防和治疗效果。     

致犊牛腹泻肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

肠毒素大肠杆菌((Ent erot oxi geni c E.col i,ETEC)是引起犊牛腹泻的主要病原之一。本试验建立了多重PCR检测ETEC毒力因子F41菌毛、K99菌毛和STa、LT肠毒素相关基因的技术方法。试验对影响PCR扩增的dNTP、引物浓度以及退火温度等因素进行优化,确定了多重PCR的特异性和灵敏性。结果表明:所建立的多重PCR方法快速、特异、灵敏,在2.5h-3h内就可以完成,为致犊牛腹泻肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供另一种选择。     

产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛抗原成熟肽的克隆表达及部分免疫学特性的分析

采用PCR方法,以83912(含K99)标准株菌液为模板扩增K99菌毛基因,克隆至pBS-T载体.提取阳性质粒,进行PCR和酶切鉴定.经测序正确后,构建原核表达载体pET-28a-K99,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,菌体蛋白经SDS-PAGE,在约18 Ku有一明显特异性条带,表达产物经初步纯化后,免疫印迹法(Western blotting)分析证实,此重组蛋白与K99阳性血清发生特异性反应.然后将初步纯化的重组蛋白免疫实验兔,并设对照组,建立间接ELISA法进行抗体检测,分析表达产物的抗原性和免疫原性,并对各组进行攻毒试验,为进一步对幼畜腹泻疫苗的研制奠定基础.     

以处理的产肠毒素大肠杆菌K99纤毛口服免疫母鸡的蛋黄…

评价了用处理的产肠毒素大肠杆菌４３１Ｋ９９纤毛的热提取抗原接种的母鸡产下的蛋制作的蛋黄粉对饲喂初乳的犊牛由异种大杆菌引起腹泻的预防效果。用羟基丙基甲基纤维素邻苯二甲酸盐沉淀和除去脂类。用喷雾干燥蛋黄中水溶性蛋白质成分制作抗体粉。给１６头饲喂初乳的犊牛口服，测定抗体粉能否预防预病力强的ＥＴＥＣ引引起的致命性牛大肠杆菌病。监视每头牛的临床反应：粪便的硬稠度，小肠内移生，体重降低和死亡率。用赋形剂处理的     

肠毒素性大肠杆菌K99-ST1融合基因的克隆及原核表达

为有效预防肠毒素性大肠杆菌（ETEC）引起的犊牛和羔羊腹泻,将PCR扩增获得的ETECK99菌毛抗原基因和人工合成的ST1基因片段,借助pUCm—T载体,构建了重组质粒pUCm-K99-ST1,从而获得了融合基因K99-ST1;使用EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切将该融合基因定向插入表达载体pET-30a中,成功构建了表达载体pET—K99-ST1,将其转入表达菌株BL21（DE3）中,经IPTG诱导,获得31ku的蛋白;Western—blotting结果显示,该融合蛋白可与K99阳性血清发生特异性反应。