禽流感与新城疫二联RT—PCR诊断方法的建立及其应用

根据禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)基因组序列高度保守区，设计合成了2对引物，以AIV、NDV培养物提取RNA并反转录，进行RT-PCR特异性片段扩增，扩增的片段大小分别为470和320bp。结果，扩增产物与设计的2对引物之间的序列大小一致。通过特异性与敏感性试验，AIV、NDV培养物均可扩增至10^-4，表明本方法对2种病毒具有快速、特异和高度敏感的特点。     

RT—PCR快速诊断猪流行性腹泻

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于冠状病毒,是一种猪肠道病原性腹泻病毒.其感染猪表现的临床症状与猪传染性胃肠炎(TCE)十分相似.虽然通过细胞培养可以进行病毒分离、诊断PEDV感染,但是PEDV只能在Vero细胞中繁殖,而且通常需要胰蛋白酶参与的情况下盲传数代,因此,有必要建立一种病原鉴别诊断方法.     

RT—PCR检测猪传染性胃肠炎病毒

根据猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）纤突蛋白S基因的5′端核酸序列设计了1对引物。该对引物扩增的目的片段长度为886bp。在优化RT－PCR反应条件的基础上，建立了检测TGEV的RT－PCR方法。用此RT－PCR方法检测56份猪腹泻粪样，同时用夹心ELISA法作对照。结果显示，RT－PCR法检测的20份阳类粪样，用夹心ELISA法检测有14份呈阳性，两者的符合率为89％。RT－PCR法比夹心ELISA法敏感性更高，可用于TGEV的诊断和流行病学调查。     

SYBR GreenⅠ荧光RT—PCR方法检测禽流感病毒

为建立检测禽流感病毒（AIV）的SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR方法，根据AIV的M基因保守区的核苷酸序列设计引物。用4株不同亚型的AIV感染MDCK细胞，收集感染6、12、24、48、72h的病毒。另外采取169份鸡的泄殖腔拭子和咽喉拭子。对上述样品的M基因进行检测，试图建立快速检测AIV的SYBR GreenⅠ荧光RT—PCR方法，并与普通RT—PCR方法和传统的病毒滴定方法进行比较。结果表明：此次建立的检测AIV的SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR方法能检测到感染MDCK细胞后72h的AIV，对169份泄殖腔拭子和咽喉拭子中的AIV检出率为5．33％（9／169），而普通RT—PCR方法检出率为6．51％（11／169），病毒滴定检出率为5．62（9／160）。对其他病毒（NDV、IBDV、IBV、VA）则未检测到，且整个检测过程只需4h，表明该方法特异、准确、快速。     

一步法RT—PCR检测禽呼肠孤病毒方法的建立与应用（摘要）

禽呼肠孤病毒 (ＡＲＶ)是呼肠孤病毒属的成员 ,在临床上主要引起鸡病毒性关节炎 /腱鞘炎、吸收障碍综合症等多种疾病。禽呼肠孤病毒感染导致鸡群的饲料报酬降低、生产能力下降、屠宰废弃率高和引起免疫抑制而造成其它疾病的并发或继发感染 ,使鸡群死亡率升高 ,其危害相当严重。目前 ,对于禽呼肠孤病毒的检测已建立起了常规的病毒分离鉴定、ＥＬＩＳＡ和荧光抗体检测方法 ,近年来 ,我们也建立了ＲＴ ＰＣＲ、半套式ＰＣＲ和核酸探针等技术。本研究的目的是建立一种更加简便的一步法ＲＴ ＰＣＲ检测禽呼肠孤病毒的技术。禽呼肠孤病毒为双链Ｒ…     

禽流感通用型RT—PCR快速检测试剂盒

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的禽流感检测方法．根据禽流感病毒高度保守的M1基因序列．设计一套通用型引物．建立了快速检测禽流感的PCR一步法．并对反应条件进行优化．组装成快速检测试剂盒．并对临床收集的15份疑似禽流感病料进行了检测。结果显示．疑似禽流感病料检出率在100％以上。检测灵敏度达10^15 ELD50,稳定性良好,冷冻至少能保存12个月。通过对临床样品的检测,证实该试剂盒具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点．值得推广应用。     

VSV的RT—PCR快速检测方法的建立

选取水泡性口炎病毒N基因序列，设计1对引物，建立检测水泡性口炎病毒的RT－PCR方法。对VSV各毒株进行检测，结果均为引性， 而对反刍动物病毒性疾病相关病毒进行检测，结果均为阴性。结果表明所建立的RT－PCR技术可用于水泡性口炎的诊断和流行病学调查。     

RT—PCR快速诊断鸽新城疫

2008年11月成都市某种鸽场5120只种鸽发生急性疾病并出现大批死亡。临床表现有下痢和歪头缩颈等明显神经症状,剖检变化有全身性的黏膜和浆膜出血,并伴有呼吸道和消化道病变,经实验室细菌分离鉴定和RT—PCR检测,确诊为鸽新城疫。目前使用LaSota、V4等鸡新城疫疫苗进行免疫,可有效地控制该病在鸽群中的流行。     

用RT—PCR检测新城疫病毒的研究

用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测新城疫病毒（ＮＤＶ）。研究结果表明ＲＴ－ＰＣＲ可检测出Ｆ４８Ｅ９株、Ｌａｓｏｔａ株、Ⅰ系疫苗株、Ｌ株、ＳＹ１株等５株ＮＤＶ尿囊液为阳性,其敏感性可测至１０－３倍稀释尿囊液病毒。ＲＴ－ＰＣＲ还能直接检测出发病鸡气管中的ＮＤＶ。     

用RT—PCR鉴别新城疫病毒不同毒力株的研究进展

本文概述了用RT－PCR技术检测新城疫病毒（NDV）的研究进展。主要介绍了鸡新城疫病毒（NDV）基因组结构以及强弱毒株F蛋白在裂解位点附近的氨基酸差异以及从感染鸡胚尿囊液提取RNA和从组织匀浆直接提取RNA,并用之作RT－PCR以鉴别NDV毒株毒力和诊断ND的研究现状及应用前景。     

马流感病毒多重RT—PCR检测方法的建立

根据马流感病毒的M基因和HA基因的保守序列,设计了两对引物,MF和MR为通用引物,可以检测出H3N8和H7N7亚型EIV,目的片段227bp,HF和HR为H3N8亚型特异性引物,目的片段595bp。利用这两对引物,通过对多重RT—PCR扩增条件的优化,建立了快速检测鉴别H3N8亚型EIV的多重RT—PCR技术。特异性和敏感性试验结果表明,该技术可以用于EIV的快速诊断和亚型鉴定。     

用RT—PCR技术检测蓝乱病病毒的研究

蓝舌病病毒非结构蛋白ＮＳ１基因在各型中具有高同源性，可作为群特异检测的依据。采用ＮＳ１基因中２１０ｂｐ的区段作为ＰＣＲ扩增模板，经逆转录酶合成第一股ｃＤＮＡ后，再进行ＰＣＲ扩增。结果对ＢＴＶ可扩增出特异片段，而鹿流行性出血病病毒和茨城病病毒则不出现扩增。     

IBDV野毒株主要结构蛋白基因RT—PCR方法的建立

借助计算机软件，在分析比较了９个传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）Ａ片段结构蛋白基因的基础上，设计并合成了２对ＶＰ２和ＶＰ３基因ＰＣＲ引物，经ＲＴ－ＰＣＲ反应条件优化选择，成功地建立了ＲＴ－ＰＣＲ方法，用于扩增ＩＢＤＶ ＶＰ２和ＶＰ２基因，经琼脂糖凝胶电泳和分子杂交鉴定，获得４个ＩＢＤＶ野毒株ＶＰ２和ＶＰ３基因，为ＩＢＤＶ分子生物学研究奠定了基础。     

犬瘟热RT—PCR诊断及临床疗效分析

犬瘟热病毒的扩散不仅给饲养场带来重大的损失,也可能给从事毛皮动物饲养、繁殖和疫病防治带来前所未有的危害.因此,试用RT-PCR检测技术对临床诊断和有效控制犬瘟热的发生具有重要意义.     

同时检测禽流感和新城疫病毒的一步法荧光定量RT—PCR方法的建立

分别根据新城疫病毒与禽流感病毒的M基因、禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计了通用型禽流感病毒、H5＼H7＼H9亚型及通用型新城疫病毒5对特异性引物和5条Taqman荧光标记核酸探针。以阳性重组质粒进行体外转录后的RNA为标准品绘制标准曲线,建立了一步实时荧光RTPCR方法。结果表明,本试验建立的标准曲线Ct值与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数大于0．99。通过利用所建立的方法与鸡胚分离法同时对新鲜采集的临床样品进行检测,2种方法的检测结果符合率为100％,说明在临床样品检测、流行病学监测方面具有良好的应用前景。     

RT—PCR技术常见问题的分析

聚合酶链式反应（Polimerasechainreaction，简称PCR技术）具有特异性强、灵敏度高、简便快速、对原始材料质量要求低的特点，为兽医分子生物技术实验室中的首选方法之一。但因该技术高度的灵敏性容易导致交叉扩增反应，出现假阳性结果等，现就其常见问题作一探讨。１PCR技术常出现的几个问题１．１假阳性实验中设立的阴性对照出现阳性结果，则实验检测结果可能有假阳性。造成假阳性的原因主要包括监测样品污染、监测试剂污染、扩增产物污染等。１．２假阴性实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，则实验可能有假阴性结果。但应注意，…