龙血树DCDPK2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术克隆龙血树CDPK基因的全长cDNA,并对基因序列进行相关分析与基因表达分析。结果表明:该基因全长为1 810 bp,编码区长度为1 587 bp,编码528个氨基酸,其氨基酸序列具有CDPK基因编码氨基酸的所有典型结构特征;经序列比对发现其核酸序列与玉米CDPK基因的同源性高达81%,氨基酸序列与其它植物中的CDPK氨基酸序列同源性很高。该基因命名为DCDPK2基因。对未经血竭诱导和诱导的龙血树组培苗进行半定量RT-PCR表达分析,发现在添加了诱导物的组培苗中DCDPK2基因的表达显著增强。     

水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达及序列分析

根据Thanatephorus cucumeris G蛋白β亚基序列（AY884129）设计引物,对水稻立枯丝核菌AG 1IA的 G蛋白β亚基基因进行了克隆。PCR结果得到1条约为1.9 kb的扩增片段,包含1个约1.7 kb的完整开放阅读框,编码366个氨基酸。同源性检索发现该序列与大量Ｇ蛋白β亚基基因明显同源,一致性介于57.34%~88.14%。根据其推导cDNA序列设计引物进行RT PCR分析,发现该基因在对数生长期表达量最高,提示水稻立枯丝核菌AG 1IA G蛋白β亚基基因可能具有时空表达特性。     

橡胶树抗病相关基因HbNPR1的克隆及其表达分析

前期利用cDNA-AFLP技术分离获得了一个与橡胶树抗棒孢霉落叶病反应相关的差异表达基因片段EST-IAN-188,通过Blast比对分析发现,该基因片段与植物抗病相关NPR基因家族中的NPR1具有高度的同源性。将该片段与橡胶树基因组序列进行比对,设计引物进行PCR扩增,得到了一个橡胶树NPR1基因的cDNA和基因组序列,命名为HbNPR1基因。基因序列分析显示,该基因编码区全长(CDS)1 374 nt,含有两个外显子和一个内含子,编码457个氨基酸,蛋白分子量为51.0 ku,等电点5.82,具有BTB/POZ、ANK锚蛋白重复序列、DUF和NPR1-like C等4个结构域。qRT-PCR定量分析发现,HbNPR1基因在橡胶叶片中的表达丰度最高,特别是古铜期叶片;多主棒孢病菌(Corynespora cassiicola)诱导下HbNPR1基因在抗病品种(IAN873)的表达丰度明显高于感病品种(PR107);另外,SA、MeJA、ET处理下均能诱导HbNPR1基因的表达,SA处理后的表达量丰度最高。本研究初步表明,HbNPR1基因可能参与橡胶树抗病信号途径的调控和寄主对病原菌侵染的防御反应。     

卡特兰ChCHS1和ChDFR1基因的克隆及表达分析

以卡特兰紫色花品种‘粉女郎’（Cattleya hybrid‘Pink Lady’）为材料,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中分离得到了一个查尔酮合酶（chalcone synthase, CHS）和一个二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase, DFR）同源基因的cDNA全长,分别命名为ChCHS1和ChDFR1,GenBank登录号分别为KP171693和KP171694。序列分析结果发现：ChCHS1的cDNA全长1 508 bp ,编码394个氨基酸;ChDFR1基因的cDNA全长1 250 bp,编码350个氨基酸。同源性检索和生物信息学分析表明,这2个基因编码的蛋白都具有各自的功能位点和保守性特征多肽序列。氨基酸序列比对与系统进化树分析显示,ChCHS1、ChDFR1基因在兰科中与蕙兰、石斛兰关系最近,与百合科关系较近。相对实时荧光定量PCR结果表明,ChCHS1 和ChDFR1都在蕾期表达量最低,伴随花朵的开放,表达量逐渐上升,最终分别在花朵盛开期和接近开放时达到最高。     

水稻谷蛋白基因GluB-6的cDNA克隆及表达

根据已克隆谷蛋白基因的保守氨基酸序列搜索基因组数据库,获得与之高度同源的水稻基因组序列,通过生物软件进行基因预测和验证,用RT PCR法克隆得到1个新的谷蛋白基因的cDNA克隆。核酸序列分析和体外表达结果表明,该基因cDNA序列全长为1517 bp,含有1个编码495个氨基酸残基的开放阅读框（ORF）,推导的氨基酸序列与谷蛋白基因家族的相似性介于53.6%~82.8%,并与B亚族谷蛋白基因的同源性更高,因此命名为GluB 6（GenBank注册号AY429651）。Northern杂交显示,GluB 6基因具有高度的胚乳表达特性。     

秋石斛‘三亚阳光’Actin 的克隆与表达模式分析

本研究克隆了秋石斛‘三亚阳光’（Dendrobium ‘Sonia Hiasakul’）肌动蛋白基因（DenActin）cDNA 全长序列, 并进行了 DenActin 进化地位和表达模式的分析。通过克隆获得的 DenActin cDNA 序列的全长为 1 596 bp,其中开放阅 读框为 1 134 bp,编码 377 个氨基酸,同时通过 gDNA 克隆获得了 DenActin 3′端的一段包含一个内含子的 403 bp 的片 段。序列同源性分析发现该基因序列与 GenBank 中注册的其他植物 Actin 核苷酸序列的同源性均在 85%以上,氨基酸 序列的同源性高达 97%以上。通过最大似然法构建其系统进化树,分析发现 DenActin 与黄石斛 Actin 的亲缘关系最为 密切,并与其他兰科植物归为一大类。半定量 PCR 分析表明,DenActin 在幼苗叶片和中苗茎尖、根、叶片以及成熟植 株的茎、根、叶片、花柄、1 mm 花苞、3 mm 花苞、5 mm 花苞、9 mm 花苞中均稳定表达。秋石斛 DenActin 的克隆和 表达模式分析为秋石斛功能基因的表达分析提供了候选的内参基因,而 3′端包含内含子的 gDNA 片段的克隆为避免实 时定量分析中的 gDNA 污染提供了引物设计的便利。     

大豆GmNCED1基因的克隆及表达模式分析

本研究以抗逆性强的大豆旱碱一号为材料,首次从中克隆了编码9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED）的GmNCED1基因全长cDNA片段,该基因编码区含有1 836个核苷酸,编码611个氨基酸。通过同源性比对分析发现GmNCED1与花生、菜豆等双子叶豆科植物NCED的同源性高达84%以上。同时,利用荧光定量PCR分析发现高盐、低温、干旱、外源ABA以及NAA处理均可以诱导该基因在大豆叶片及根中表达。本研究初步揭示GmNCED1基因在植物逆境胁迫中的作用,为基因工程育种提供优质的候选基因。     

苎麻纤维素合成酶基因BnCesA4 cDNA序列的克隆与表达分析

利用本地BLAST工具,从先期获得的苎麻转录组数据中发掘出与多种植物纤维素合成酶基因有较高同源性的序列CL6473.以苎麻（Boehmeria nivea）栽培种湘苎3号为材料,根据CL6473设计引物,先采用PCR扩增克隆了苎麻一个纤维素合成酶基因cDNA的核心片段,再运用5′及3′RACE获得该基因全长cDNA,序列分析表明该cDNA为一个新的苎麻纤维素合成酶基因cDNA,命名为BnCesA4.BnCesA4cDNA序列全长4008bp,其中编码区全长3270bp,编码一个含1090aa的多肽,具有植物纤维素酶的保守结构域及特征氨基酸序列.根据该cDNA高可变区序列设计其特异性引物,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对BnCesA4基因在几个代表性苎麻品种：湘苎3号、湘苎1号、湘潭大叶白及城步青麻的木质部和韧皮部两种组织中的表达情况进行了定量分析.qRT-PCR显示BnCesA4基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部均有表达,表达量差异不大.     

茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆和序列分析

从茶树叶片中提取总RNA ,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板 ,分别用三对PCR引物扩增SAM合成酶基因的中间主片段、 3 端和 5 端片段 ,最后经BLAST比较及重叠区域拼接得到完整的SAM基因序列。所得序列长 130 3bp ,编码 394个氨基酸。与中华猕猴桃、番茄、长春花SAM合成酶基因的核苷酸序列的同源性分别为 87% ,83 %和 83%。氨基酸序列与三角杨、猕猴桃、番茄、长春花等的SAM氨基酸序列的同源性为 92 %～ 90 %。证实所获得的基因序列为茶树SAM合成酶基因     

红海榄脱水素基因(RsDHN1)的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术对已获得的红海榄根部其中一个差异表达基因进行克隆,通过Blast分析和序列比对可知,该基因全长cDNA序列包括146bp的5'端非编码区,43bp的3'端非编码区和一个编码241个氨基酸的开放阅读框,命名为RsDHN1基因。该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SKn类脱水素蛋白,与其它植物的SKn类脱水素蛋白具有43%～55%的氨基酸序列同源性。半定量RT-PCR分析表明,盐胁迫对RsDHN1基因的表达有明显上调作用。     

茶树亲环素基因cDNA全长的分析鉴定与原核表达

通过对茶树新梢cDNA文库大量随机测序,获得了一个编码亲环素的全长基因,在GenBank登录,登录号为DQ904327。茶树亲环素基因cDNA全长949 bp,其中开放阅读框全长495 bp,编码蛋白质含有164个氨基酸,分子量约为17.47 kD,等电点约为8.54,它具备5’端非编码区的“CAAT”标志及3’端非编码区的”AATAAA”poly-A加尾信号。其推测的氨基酸序列经与26条其他生物亲环素蛋白氨基酸序列进行CLUSTAL W多序列联配并以Neighbor-Joining法进行进化树构建后,发现与水稻和小麦的相似性较高,达到85%以上。根据亲环素基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达载体pET/Csin-Cyp,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个分子量为23 kD的亲环素融合蛋白。     

矮化大豆GmEXPA5基因的克隆与表达分析

以矮化大豆HK808的顶芽cDNA为模板，根据植物α-膨胀素基因保守区设计简并引物，并克隆保守区片段，结合RACE 技术克隆得到一个新的膨胀素全长基因，将其命名为GmEXPA5（登录号为JN207916.1），该基因全长1 233bp，其中开放阅读框636bp，编码211个氨基酸；推导的氨基酸序列经分析发现，该序列含有两个膨胀素保守域domain1（expansin EG45）和domain2（expansin CBD），无明显的信号肽序列，属于α膨胀素亚家族。构建pEASY-Blunt E1-GmEXPA5重组质粒，获得稳定的原核表达体系，IPTG 诱导后SDS-PAGE 结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。实时荧光定量PCR（real-time PCR）表达分析表明GmEXPA5基因在矮化大豆HK808与野生型大豆东农42两种材料的不同器官中均有表达，而在野生型茎尖及茎部的表达量显著高于矮化大豆，推测该基因与大豆矮化性状的形成可能有一定的关系。     

巴西橡胶树HbMYC1基因的克隆及序列分析

从GenBank中搜索到1条来自橡胶树的MYC(Myelocytomatosis)家族基因EST序列,以该序列为保守区,通过RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,共1817bp。通过BLAST工具搜索GenBank数据库,结果表明,该cDNA序列同其他植物的MYC家族基因高度同源,认为该cDNA序列为橡胶树MYC家族成员。利用GenScan和Clastal X对该序列进行分析,推测其编码区长度为1428bp,编码476个氨基酸。生物信息学分析结果表明,巴西橡胶树的MYC基因编码的氨基酸序列与其他物种的相似性很高,同时推导的蛋白质序列中还存在着1个螺旋-环-螺旋的DNA结合区域和1个核定位信号,表明克隆到的基因是1个MYC家族成员的转录因子。     

杂交稻与亲本稻米蛋白质及氨基酸含量的关系

分析了８个三系杂交稻Ｆ１稻米与其相应的５个恢复系和３个不育系及其相应的３个保持系稻米的蛋白质含量和１７种氨基酸含量。结果表明，各组合（系）的蛋白质含量与其氨基酸的绝对含量正相关；杂交稻Ｆ１稻米的蛋白质含量与氨基酸含量高于其相应的恢复系稻米的蛋白质含量和氨基酸含量；不育系稻米的蛋白质含量与氨基酸含量高于其相应保持系稻米的蛋白质含量与氨基酸含量。由此认为，杂交稻稻米蛋白质含量与氨基酸含量受其细胞质基因影响；杂交稻Ｆ１与其三系亲本的蛋白质与氨基酸含量的差异可能是杂交稻表现杂种优势的重要生理基础。     

芒果炭疽病菌环境pH信号调控基因PalF的克隆与分析

通过本地查找胶孢炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)橡胶菌株全基因组测序数据,获得PalF基因的序列信息。利用同源克隆的方法扩增胶孢炭疽病菌芒果菌株PalF基因,获得片段大小为2 369 bp的目的基因片段。对该基因序列进行分析发现,该片段含有完整的开放式阅读框,与橡胶炭疽菌PalF基因的序列同源性达100%。用RT-PCR的方法获得PalF基因的cDNA序列,序列进行分析发现该基因全长为2 310 bp,其中含有1个大小为59 bp的内含子,推测编码769个氨基酸。对PalF基因的氨基酸序列进行推测保守结构域分析可知PalF蛋白中含有Arrestin-C保守结构域,推测该基因参与环境pH感应信号转导途径(Ambient pH-sensing signal transduetion pathway)的调控,为进一步研究该基因在环境pH感应信号转导途径中的作用奠定了基础。     

水稻中一个与OsHSP90互作的新基因特性分析

 OsHSP90是水稻中一类可以在不同逆境条件下被诱导的基因。利用酵母双杂交系统,在水稻低温和干旱cDNA文库中筛选出1个与OsHSP90互作的未知基因,命名为OsHSPBP。序列分析表明,该基因全长1321 bp,编码一个具有244个氨基酸残基的多肽,推测分子量为25.5 kD。在OsHSPBP蛋白的97-132位氨基酸残基间存在tify功能域,185-211位氨基酸残基构成CCT_2基序,与其他植物中的同源蛋白相似性介于30.66%～70.40%。经分析,该基因启动子区域存在6种不同的逆境反应顺式作用元件。RT PCR半定量结果表明, OsHSP90与OsHSPBP在逆境胁迫下,均能被不同程度地诱导并呈现相似的表达趋势,说明两者可能与水稻逆境胁迫的应答和信号传递有关。     

一个辣椒PHD-finger家族转录因子CaPHD1的克隆及其表达分析

以辣椒均一化cDNA文库为模板,通过PCR扩增获得CaPHD1基因克隆,该基因序列含有1个220个氨基酸序列的开放阅读框,同其他植物具有62%~89%的氨基酸同源性。在植物亚细胞定位实验中CaPHD1与GFP的融合蛋白定位于细胞核;实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因受到青枯菌侵染和水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯和脱落酸等外源激素的诱导,表明CaPHD1可能在应答病原菌中起重要的作用。     

香蕉枯萎病菌pgx4基因的克隆与序列分析

为了解pgx4基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间的致病力差异的关系,以尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种和4号生理小种的基因组DNA和cDNA为材料,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的pgx4基因,并对扩增产物进行克隆测序后再用生物信息学软件对序列进行比对分析.结果表明:2个生理小种pgx4基因的开放阅读框均为1 395 bp,编码465个氨基酸,且前17个氨基酸均构成该基因的信号肽.通过DNAStar 7.1比对发现,尖孢镰刀菌古巴专化型2个生理小种pgx4基因的核苷酸序列存在25个碱基的差异,而其编码的465个氨基酸中,也有3个氨基酸不同,分析这些核苷酸序列和氨基酸序列的差异可能与尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种和4号生理小种在侵染蕉类不同栽培种时的识别专性寄主机制有一定关系.     

胶孢炭疽病菌环境pH应答转录调控因子基因的克隆与分析

参照油梨炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的环境pH应答转录因子基因Pacl设计l对特异性引物,以芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)基因组DNA为模板,扩增获得大小为2 625 bp的目的基因片段.序列分析结果表明,目的片断包含完整的阅读框,与油梨炭疽病菌C.gloeosporioides pac1基因相应片段长度相同,二者碱基序列同源性达97%.用RT-PCR技术获得pacl基因cDNA片段,证实目的基因片段中存在3个大小分别为59,50,71 bp的内含子.拼接的全长cDNA长1 755 bp,推测编码的氨基酸序列长584个氨基酸残基,与推测的油梨炭疽病菌pacl基因所编码的蛋白质同样大小,二者氨基酸序列相似性达99%,只有1个氨基酸的差异,可以肯定克隆的目的片段为C.gloeosporioides pac1基因,为进一步研究C.gloeosporioides侵染芒果时的pH调控奠定了基础.