不同O/L值花生品种油酸脱氢酶基因的时空表达特征

本研究以不同油酸/亚油酸比值（O/L比）花生品种为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对四个不同O/L花生品种不同组织中油酸脱氢酶基因（FAD2）的表达进行相对定量分析。结果表明：FAD2基因在不同O/L基因型中组成型表达,其在根、茎、叶中表达量低,在花中表达量最高,显著高于荚果等其它组织中的表达量,且品种间差异达显著水平;花U606和花U12在花、幼荚、成熟荚果中的表达量呈依次下降趋势;花育17和狮油红4号在花、幼荚、成熟荚果中的表达量则呈现高-低-次高的表达趋势,差异达显著水平。       

二化螟实时荧光定量PCR内参基因筛选和表达稳定性评价

【目的】筛选特定试验条件下二化螟(Chilosuppressalis)稳定表达的内参基因,为二化螟基因表达研究奠定基础。【方法】根据二化螟转录组测序结果挑选出11个候选基因,利用实时荧光定量PCR测定其在二化螟不同发育历期、不同组织、温度处理、杀虫剂处理、取食不同饲料、取食不同水稻、dsRNA处理和混合样品的表达量,利用RefFinder、BestKeeper、Ge Norm和NormFinder等软件和ΔC_t值对11个候选基因的稳定性进行评估。【结果】5种分析方法表明,在二化螟不同发育历期稳定性较高的内参基因是AK、RPL10和EF1,不同组织中稳定性较高的内参基因是EF1、TUB和ACTB,不同温度下较稳定的内参基因为TUB、RPL10和EF1,杀虫剂处理样品中较稳定的是TF4和ACTA,取食不同饲料较稳定的是TUB、TF4、EF1和RPL10,取食不同品种水稻较稳定的是TUB和EF1,dsRNA处理样品中较稳定的是TUB、AK、ACTB和EF1,混合样品中较稳定的是EF1、TUB和ACTB。【结论】为不同试验条件下选择合适的内参基因提供了参考,也有利于在二化螟基因表达研究中获得更加可靠准确的数据。     

牛樟芝不同发育阶段菌丝体实时荧光定量PCR中内参基因的筛选

实时荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）技术具有较高的敏感性、准确性和特异性,被广泛应用于基因表达分析。在基因表达分析中,选择合适的内参基因是衡量样品表达量和准确性的重要前提和保障。本研究以液体发酵7、21、35 d的牛樟芝菌丝体为样本,采用qRT-PCR技术检测牛樟芝菌丝体内Actin、TPK、Floxuridine、CAP-Gly、α-Amylase、Phosphatase、HA2-helicase、MAGT1等8个候选内参基因在3组样本中的表达水平,采用geNorm、NormFinder、BestKeeper 3个软件对其分别进行稳定性比较和评价。结果表明,geNorm软件计算得出Floxuridine、HA2-helicase、TPK、CAP-Gly在牛樟芝菌丝体中具有更高的稳定性;NormFinder软件计算得出TPK、CAP-Gly、Floxuridine、HA2-helicase在牛樟芝菌丝体中具有较高的稳定性;BestKeeper软件计算得出HA2-helicase的表达水平最好,其次是TPK和MAGT1。综合分析结果认为TPK和HA2-helicase比其他内参基因更稳定,更适合作为牛樟芝菌丝体研究的内参基因。可见,通过牛樟芝菌丝体转录组数据来筛选和挖掘稳定表达的内参基因具有可靠性、高效性和可行性,为牛樟芝菌丝体基因表达分析提供了可靠的内参基因。     

澳洲坚果实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

澳洲坚果是重要的热区经济作物,目前国内外尚无关于澳洲坚果实时荧光定量PCR分析内参基因的报道。选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析准确性的先决条件。为筛选澳洲坚果实时定量PCR最适内参基因,以澳洲坚果的根、茎、叶、果皮、果仁为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对18S rRNA,Actin,CYP,EF1a,EF1b,GAPDH,MDH,TUBa,TUBb,UBQ,UBC等11个常用的内参基因在澳洲坚果不同组织中的表达稳定性进行了分析。geNorm软件分析的最适内参基因数目为2,最稳定内参组合为MDH和EF1b,TUBa基因的稳定性最差。BestKeeper分析结果认为,MDH基因表达最稳定,EF1b次之,与geNorm结果一致。NormFinder软件稳定性分析显示,GAPDH最稳定,其次是CYP基因;TUBa基因表达最不稳定。ΔCt算法结果表明,18S基因表达最稳定,其次是GAPDH基因,MDH和EF1b排第3和第4。RefFinder综合排序为：MDH>18S>GADPH>EF1b>CYP>UBC>EF1a>Actin>TUBb>UBQ> TUBa。因此,MDH基因在澳洲坚果不同组织中表达最稳定,初步确认可以作为实时荧光定量PCR分析的校正内参基因,在澳洲坚果的基因表达模式分析中具有重要意义。     

铝胁迫下橡胶苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选

铝毒是热带地区酸性土壤上抑制作物生长的主要因素,但目前关于铝活化后对橡胶树生长和产胶的影响及橡胶树耐铝机制的研究很少。为了筛选出橡胶树在铝毒胁迫下稳定表达的内参基因用于实时荧光定量PCR分析,本研究选择了Actin、Actin7、18S rRNA、40S rRNA、YLS8、UBC2、UBC4、GAPDH、FP和ADF等10种常见的基因作为候选内参基因,通过qRT-PCR检测,利用内参基因评价软件geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct算法以及综合评价软件RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评估。综合评价结果表明,铝胁迫后表达稳定性排名前3的内参基因依次分别为UBC4、40S rRNA和FP。进一步选取UBC4、40S rRNA、FP基因和UBC4+40S rRNA+FP基因组合以及稳定性较差的GAPDH基因作为内参基因对橡胶树铝诱导苹果酸分泌转运蛋白基因HbALMT-1和HbALMT-2进行相对表达分析,结果显示2个目的基因相对于3个内参基因及其组合均显示出一致的表达水平,而稳定性较差的内参基因GAPDH未能准确地对目的基因的表达量进行校正。综上所述,筛选出UBC4、40S rRNA和FP基因以及UBC4+40S rRNA+FP基因组合可作为铝毒胁迫不同天数下表达最稳定的内参基因,可用于铝毒胁迫下橡胶树相关基因的表达分析。     

菠萝蜜实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

为筛选菠萝蜜实时荧光定量PCR研究用的内参基因,以菠萝蜜不同发育阶段的果实、叶和花序为材料,分析GAPDH、18S rRNA、UBQ、ɑ-tubulin和β-tubulin 5个内参基因的表达情况,并对其表达稳定性进行分析。结果表明,在各组织不同发育阶段中,5个内参基因的表达丰度变化存在差异;geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种方法得出的结论有所不同,经RefFinder综合评价后,果实中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、18S rRNA;叶片中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、β-tubulin;花序中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、ɑ-tubulin。     

甘蔗基因表达定量PCR分析中内参基因的选择

以甘蔗接种黑穗病菌后0、6、12、24、48、60和72 h时间点的材料为研究对象,应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR Real-time qPCR)技术,探讨25S rRNA、GAPDH、β-actin和β-tubulin4个内参基因mRNA水平的表达情况.经geNorm程序统计学分析,4种内参基因的表达稳定性各异,25S rRNA>GAPDH>β-actin>-tubulin,其中以25S rRNA表达稳定性最好,且根据该基因设计的两对定量PCR引物都是可行的.同时,甘蔗PPO基因表达特性的定量PCR分析也显示,甘蔗PPO基因与植物的抗病性相关.结果显示,研究中所筛选的内参基因是合适的.     

水稻低丰度表达基因OsAMT1;3实时荧光定量PCR方法的建立及其应用

采用实时荧光定量PCR技术,通过使用特异引物,对水稻中的低丰度表达基因OsAMT1;3进行了转录水平上的定量分析,成功建立了可检测低丰度表达基因的SYBR Green实时荧光定量PCR技术平台。该方法具有很好的准确性和实用性。获得的荧光定量PCR扩增曲线,基线平整,指数区明显,斜率大且固定;线性范围广,17～36个循环都能测出;稳定性、重复性好,变异系数仅为0.47%;标准曲线表明,循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,可对基因表达进行相对定量;缺氮条件下OsAMT1;3 与纯NH4+处理相比表达量增加4倍以上。     

实时荧光定量PCR筛选稻曲病菌内参基因

 通过实时定量PCR分析了稻曲病菌中5个传统内参基因18S rRNA、GAPDH、ubiquitin、β actin、α tubulin的mRNA差异表达情况,并利用geNorm软件分析了它们在4个发育时期和NaCl胁迫处理中的表达稳定性。结果表明,在菌龄为7 d、8 d、9 d、10 d的稻曲病菌中,α tubulin 2和β actin表达稳定;在0.4 mol/L  NaCl溶液处理0 h、4 h、8 h、12 h、16 h后,β actin和α tubulin 2表达稳定。因此,当利用荧光定量PCR分析比较稻曲病菌基因表达差异时,可选择α tubulin和β actin作为内参基因。     

茶树叶片GDH、GS、GOGAT基因的克隆及荧光定量PCR分析

以4个茶树种质为试验材料,克隆得到茶叶中氨基酸合成转化关键酶基因：谷氨酸脱氢酶（GDH）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酰胺α-酮戊二酸氨基转移酶（GOGAT）的保守区。在GenBank登录号分别为：JN602371、JN602372、JN602373。通过SYBR Green I实时荧光定量PCR检测,发现GDH酶基因在茶树种质0314C（相对高氨基酸种质）中的表达显著增强,而在0212-15种质（相对低氨基酸种质）中却显著下降。GS、GOGAT酶基因在种质0314C中表达显著下降,而在0212-15、0318D种质中显著增强。通过回归分析,GS基因表达与茶氨酸、赖氨酸、丙氨酸呈负相关,而GDH与茶氨酸呈正相关。     

核酶基因转化番木瓜的研究

利用酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ,Ｒｉｂ．）基因转化番木瓜（Ｃｗａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ Ｌ．）探索培育抗番木瓜环斑病毒（Ｐａｐａｙａ Ｒｉｎｇｓｐｏｔ Ｖｉｒｕｓ,ＰＲＶ）品种的新途径。用三亲交配法将切割ＰＲＶ ＲＮＡ的Ｒｉｂ,基因的表达载体（Ｐ３５ｓ／ＮＰⅡ,Ｒｉｂ）,转入农杆菌ＬＢＡ４４０４,采用农杆菌介导转化将Ｒｉｂ,,基因和ＮＰＴⅡ基因导入番木瓜细胞的核基因组中。其培养的外植体在含有Ｋａｎ．１０     

番木瓜果实膨胀素基因部分序列的克隆及分析

膨胀素(Expansin)是一类存在于植物细胞壁上,并能快速缓冲张力,使植物细胞壁松驰的蛋白质。以成熟番木瓜果实总RNA反转录得到的cDNA为模板,设计简并引物进行PCR,得到1个大小为531bp的基因片段,编码177个氨基酸,并存在expansin的保守区域,命名为Cp-EXP1。番木瓜expansin的成功克隆为研究番木瓜的生长发育以及其品种的改良等打下了良好的基础。     

番木瓜酪氨酸氨基转移酶基因CpTAT的分离与分析

番木瓜酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase,TAT)是维生素E合成途径中的一个关键酶。在已有番木瓜果实成熟差异基因片段序列的基础上,采用RACE技术克隆了TAT基因的全长c DNA序列,命名为Cp TAT。该基因全长包含5′非编码区98 bp,3′非编码区232 bp,开放性阅读框1 266 bp,编码421个氨基酸。序列分析表明,该基因为谷草转氨酶超家族成员,催化活性位点为第253位的赖氨酸,编码蛋白与毛果杨、野草莓、桃、拟南芥和水稻的TAT蛋白同源性分别为83.69%、81.09%、80.76%、78.87%、54.67%。荧光定量分析表明,Cp TAT基因在根中的表达量最高,在茎和果实中的表达较低,在叶中的表达量最低。与对照相比,外源乙烯处理能诱导番木瓜果实中Cp TAT基因表达量升高,而1-MCP处理则抑制了该基因表达,在果实衰老期表达量升高,该基因可能在番木瓜果实成熟衰老中起作用。     

番木瓜畸形花叶病毒hc-pro基因保守基序FRNK点突变对病症表现的影响

为研究番木瓜畸形花叶病毒（PLDMV）hc-pro基因保守基序FRNK对病症表现的影响,本研究采用定点突变的方法,获得了PLDMV-DF的hc-pro基因保守基序FRNK的精氨酸（R）突变为异亮氨酸（I）的突变体克隆p35SPLDMV-GFP-R183/I,该位点突变显著减轻了PLDMV在番木瓜上的病症表现,表明是影响其致病性的关键位点。本研究结果为利用交叉保护防控番木瓜畸形花叶病毒病提供了重要参考和材料。      

Real-time PCR检测大豆CONSTANS基因在不同光照条件下的表达

采用实时荧光定量PCR方法检测了不同感光大豆品种的CO(CONSTANS) 基因在不同光照条件下的mRNA水平变化.结果表明:早熟品种东农49和晚熟品种东农42各自在短日照(8h/16h 光/暗)下会比长日照(16 h/8 h 光/暗)下表达有所增强,同时东农49中CO基因的表达要高于东农42,它们的表达峰值均出现在光暗交界处.东农42由长日照或短日照移入完全光或完全暗条件时,暗下CO基因的表达量剧增,并且大致维持之前长日照和短日照的表达规律.CO基因的表达有很强的昼夜节律性,暗下利于其表达,并且在不同感光品种中表达有所不同.     

玉米株型相关基因ZmDwarf2的克隆及表达分析

以玉米紧凑型自交系豫82、平展型自交系沈137为材料,利用同源克隆法成功克隆了与水稻Dwarf基因同源的玉米Dwarf2基因,该基因水稻上通过参与BR生物合成途径调控其株型形态建成。序列分析发现,玉米Dwarf2基因cDNA序列全长1 501bp,开放阅读框1 398bp,编码465个氨基酸。与水稻Dwarf基因的同源度达84%。实时荧光定量PCR分析表明,豫82、沈137中Dwarf2基因表达趋势基本一致,3～4叶期表达量低,8～12叶期处于表达高峰,13叶期后表达量逐渐下降。沈137中表达量较豫82高;就不同器官来说,沈137在叶片、叶枕、叶鞘、茎尖等器官中表达量较豫82高,其中,叶枕处ZmDwarf2表达量相对较高,而叶鞘上ZmDwarf2表达量相对较低。可以推测,基因ZmDwarf2可能参与玉米中BR生物合成途径,进而调控其相关株型形态建成。     

玉米株型相关基因ZmDwarf4的克隆及表达分析

以松散型玉米自交系沈137为材料,利用同源克隆法成功克隆与水稻Dwarf4基因同源的玉米Dwarf4基因。序列分析发现,该基因cDNA序列全长1 626 bp,开放阅读框1 521 bp,编码506个氨基酸,与高粱、水稻、拟南芥的氨基酸同源性分别为95%、89%和71%。Real-Time PCR分析表明,ZmDwarf4基因的表达量为3～11叶期表达量逐渐增加,9～11叶期达到最大量,12～19叶期表达量逐渐降低,推测ZmDwarf4基因正向调控玉米叶夹角的大小。ZmDwarf4基因的表达量在叶片中最高,在叶枕中最低。不同激素处理的结果表明,用植物激素（IAA）处理的样品ZmDwarf4基因的表达量始终高于对照;用Brassinolide（BR）处理的样品6叶期ZmDwarf4基因的表达量高于对照,7～10叶期该基因的表达趋势与对照基本一致,但始终低于对照;用IAA+BR处理的样品,该基因的表达趋势与对照基本一致,但高于对照。ZmDwarf4参与玉米BR生物合成途径,进而调控其相关株型建成。     

Proteomic Analysis of Tomato (Lycopersicum esculentum var. cerasifarm) Expressing the HBsAg Gene by 2-dimensional Difference Gel Electrophoresis

In a previous study, an HBsAg gene-bearing transgenic tomato line was made available and it exhibited notable physiological alterations compared with the non-transgenic tomato (control). In particular, leaves of the transgenic plants were fleshy and dark. We hypothesized that a change in leaf proteins of the transgenic plants account for the observed phenotypes. In this study, total protein content in leaves of the transgenic plants was analyzed by 2-dimensional difference gel electrophoresis. A total number of 700 protein spots were detected on silver-stained gels, of which 368 protein spots were matched between the control and sample gels. Among these matched proteins, the expression levels of 122 proteins in the transgenic plants were upregulated while those of the rest were downregulated. In addition, 25 abundant proteins (value ratio?>?2.0) on silver-stained gels were analyzed by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Sixteen differentially expressed proteins were identified, of which 13 were predicted to be involved in cell division, energy metabolism, protein synthesis and processing. The possible roles of these proteins in the transgenic tomato strain have been discussed. Taken together, our data indicate that significant alterations in protein expression occur in transgenic tomatoes bearing the HBsAg gene. Our findings will help broaden our knowledge of the mechanism by which exogenously expressed genes lead to phenotypic alterations in transgenic plants.     

Allergenicity Assessment of Genetically-modified Tobacco Expressing Salt Tolerance cbl Gene

It is mandatory to assess the allergenic potential of genetically modified (GM) crops before their commercialization. Recently, a transgene [Calcineurin B-like (CBL) protein] has been introduced into tobacco plant to make the crop salt resistance. Therefore, it was felt necessary to assess the allergenic potential of the cbl gene product, which was introduced and expressed in Nicotiana tabacum (tobacco) plant and compared the allergenic effects with the wild-type (WT) counterpart. Bioinformatic analysis revealed that there was no significant sequence homology with known allergens. Also, no difference between the protein digestibility profiles of GM and WT tobacco was found. Rapid digestion of CBL protein (Mol Wt 35 kDa) by simulated gastric fluid (SGF) indicated reduced chances of this protein to induce allergenicity. In addition, BALB/c mice sensitized by intraperitoneal administration of WT and GM tobacco protein showed comparable levels of clinical score, specific IgE, IgG1, histamine level, similar effect on different organs as well as IgE binding proteins. These findings indicate that insertion of cbl gene in tobacco did not cause any additional allergic risk to consumer and the GM and native tobacco proteins behave similarly in both in vitro and in vivo situations even after genetic modification.