影响农杆菌介导的花生遗传转化条件的研究

利用花生幼叶高效再生体系,对影响农杆菌介导的花生遗传转化条件,抗生素（Km）筛选压、预培养时间、共培养时间进行了研究。最后确立的转化条件为：Km筛选压为100mg/L,预培养时间为1~2d,共培养时间为3d。并对得到的再生植株进行了PCR检测,初步证实了目的基因转到了花生基因组中。     

四川小麦优良受体基因型筛选及农杆菌转化因素优化

为了丰富栽培小麦转化受体基因型,优化农杆菌转化小麦幼胚的技术体系,本研究评价了21份四川优良小麦品种(系)的幼胚再生能力,并以筛选到的最佳受体为材料,利用正交设计研究了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、抑菌剂浓度、共培养方式和农杆菌菌株等易互作的6个因素对幼胚抗性愈伤再生率的影响,并探讨了筛选剂卡那霉素(Kanamycin)的适宜浓度。结果表明,21份材料中‘5157’、‘川农16’、‘R364’、‘川麦42’‘、内麦8号’的绿苗率超过了30%,可作为优良转基因受体加以利用。以‘5157’为受体材料建立农杆菌转化体系,正交试验表明菌液浓度和农杆菌菌株对幼胚抗性愈伤再生率的影响达到显著水平,而其他因素影响不显著。经优化后的遗传转化体系为:农杆菌菌株用C58C1,幼胚不经预培养,在菌液OD值为0.4的农杆菌中侵染40 min,共培养介质选用培养基,抑菌剂为200 mg/L羧卞青霉素(Carbenicillin),适宜的卡那霉素筛选浓度为50 mg/L。本研究为四川小麦遗传转化提供了5个候选基因型,为建立和优化小麦幼胚转化技术体系提供了理论依据,同时初步建立了农杆菌转化小麦幼胚的技术体系。     

蓖麻子叶节遗传转化研究

利用前期构建的P450基因的RNAi植物表达载体侵染蓖麻受体材料,旨在获得转P450基因的阳性株。以蓖麻品种通蓖5号为试验材料,利用根癌农杆菌介导法转化蓖麻子叶节,研究影响子叶节遗传转化的若干因素。结果表明:子叶节对Kan较为敏感,适宜筛选质量浓度为250 mg/L;外植体预培养2～3 d,侵染用农杆菌菌液OD600=0.8,侵染时间10 min,共培养3 d,可获得较高的遗传转化效率。再生植株经PCR和Southern Blot检测,证明为转基因植株。     

葡萄叶盘法基因转化中抗生素种类和浓度的筛选

本研究以优良无核葡萄品种莫利莎葡萄试管苗为试材,研究了卡那霉素（Kan）、潮霉素（Hyg）对葡萄继代苗生长和离体叶片再生的影响,以确定叶盘法基因转化的选择压和转化体的筛选浓度;同时研究了不同浓度的头孢霉素（Cef）和羧苄青霉素（Carb）对葡萄离体叶片再生的影响,以确定侵菌共培养后合适的抑菌抗生素种类和浓度。试验结果表明葡萄继代苗对Hyg的敏感性强于Kan,葡萄遗传转化更适合使用潮霉素磷酸转移酶基因作为选择标记。Hyg 3.0mg/L即达到继代苗致死浓度,可作为转化后抗性苗的筛选浓度,Hyg 0.8mg/L完全抑制叶片不定芽的分化,可作为叶盘法转化时抗性芽的选择压。葡萄叶盘法基因转化中抑制农杆菌生长的抗生素可选用Cef 300mg/L或Carb 400mg/L,但对不定芽的分化有抑制作用。     

杂交鹅掌楸转双价抗病基因影响因子研究

本研究利用在固体培养基上长期保存的杂交鹅掌楸胚性愈伤为外植体,对杂交鹅掌楸进行了遗传转化的研究.对于影响转化效果的众多影响因素,本研究主要讨论了乙酰丁香酮、菌液浓度、侵染时间对杂交鹅掌楸转化结果的影响.试验结果表明,在预培养阶段,乙酰丁香酮的使用有利于转化效率的提高,最佳条件时浓度100 mg/L,预培养4 d.而在共培养阶段,乙酰丁香酮的使用和延长共培养时间并不能显著提高杂交鹅掌楸的遗传转化效率.同时,在侵染时,不同菌液浓度和不同侵染时间对转化结果的影响也无显著的差异.通过PCR检测经过筛选培养获得的阳性植株,初步验证了外源基因已经整合到杂交鹅掌楸基因组中.     

农杆菌介导法将LFY基因导入嘎拉苹果的研究

以嘎拉苹果叶片为外植体,利用GUS瞬时表达率,对农杆菌介导法转化苹果的因素进行优化.结果表明:卡那霉素(Km)选择压在30 mg/L时,外植体预培养2～3 d后以OD600=0.3～0.5农杆菌菌液浸泡3～5 min,共培养3 d,延迟筛选3 d可明显提高M2叶片转化效率,GUS阳性率达50%.PCR检测初步证明,LFY基因已整合到苹果再生植株中.     

根癌农杆菌介导的马铃薯DM茎段遗传转化条件的优化

本研究利用以双单倍体马铃薯DM的茎段为试验材料,对影响马铃薯遗传转化的条件进行了优化,主要从对通过抗生素浓度、预培养时间、侵染时间、农杆菌浓度和共培养时间等几个因素进行了的分析,对影响马铃薯遗传转化的条件进行了优化。研究表明:头孢霉素(cef)的浓度在600 mg/L时既不影响愈伤的正常生长还能有效的抑制农杆菌的生长。潮霉素(hyg)浓度在8 mg/L时对愈伤达到半致死状态,是因为较低的潮霉素浓度无法起到对抗性愈伤的筛选作用,所以合适的浓度应为愈伤达半致死状态浓度。得到更多抗性愈伤的最佳条件为:外植体预培养时间13天,侵染时间为8 min,农杆菌浓度以OD600=0.4左右,且共培养时间3天。上述的条件的优化大大的提高了马铃薯DM的遗传转化效率。     

农杆菌介导小麦遗传转化条件的优化

本研究以普通小麦品种扬麦15和Alondra's的幼胚产生的愈伤组织为受体材料,通过检测gus基因的瞬时表达情况,研究了农杆菌介导的主要影响因子的转化效率。研究结果表明,在相同条件下两个品种农杆菌侵染的最佳条件不尽相同。扬麦15的最佳优化条件为:先在不添加AS的培养基中预培养,然后在菌液浓度为OD600=0.2、AS浓度为100μmol/L条件下侵染10min,最后在25℃共培养1d;Alondra's则在菌液浓度为OD600=0.5、共培养时间为2d时,表现出最佳的gus基因瞬时表达率。为小麦的遗传转化提供参考。     

根癌农杆菌介导的磨盘柿遗传转化体系的优化

以磨盘柿叶片为外植体,通过农杆菌介导法,建立了ACC合成酶基因(ACS)遗传转化体系。研究了预培养时间、农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间和乙酰丁香酮(AS)浓度等因素对基因转化的影响。结果表明:适宜的预培养时间为2 d;用OD600值为1.0的菌液侵染15 min、共培养3 d,AS浓度200μmol/L有利于提高转化频率。经PCR分子检测,初步确定ACC合成酶基因已转入磨盘柿组培苗中。     

美洲黑杨杂种优良无性系转抗虫基因(Bt和CpTⅠ)的研究

以美洲黑杨杂种优良无性系南林895杨(Populus×euramericanac‘v.Nanlin895’)为转基因受体材料,以嫩芽或腋芽为外植体材料组织培养再生植株,利用农杆菌介导法转化Bt基因和CpTI基因。结果显示较合适的组培再生与遗传转化系统为:叶分化培养基为MS+6-BA0.5mg/L+TDZ0.002mg/L,芽伸长培养基为MS+6-BA0.2mg/L+TDZ0.001mg/L+Km10mg/L+Carb500mg/L,生根培养基为1/2MS;预培养3d,菌液浓度OD6001.0～1.3左右,侵染时间20min,共培养4d,叶盘转化频率可达28.7%。对Kmr植株经PCR分析,筛选获得了18株整合有Bt基因和1株整合有CpTI基因的转基因植株。部分转基因植株的初步饲虫实验表明,饲喂转基因杨树叶片可明显抑制杨小舟蛾的生长发育。     

农杆菌介导高粱遗传转化的相关因素优化

为建立一个稳定的高粱遗传转化体系,以高粱RHMC品种为试验材料,采用内含有P ^CAMBIA3301质粒载体的根癌农杆菌EHA105介导的方法研究了高粱遗传转化的相关因素。结果表明,外植体预培养2d,GUS表达效果最好;在侵染液和共培养基中加入200μmol/L乙酰丁香酮时,GUS表达效果最好;侵染液浓度OD₆₀₀值的适宜范围为0.8~1.0;农杆菌侵染愈伤组织的适宜时间为5~10min;共培养的适宜时间为2d。初步建立了一套高粱遗传转化体系,为今后高粱转化提供一些参考。     

超声波辅助农杆菌介导SeNHX1基因转化紫花苜蓿的研究

为建立高效快速的紫花苜蓿遗传转化体系,以紫花苜蓿6个栽培品种为材料,采用超声波辅助农杆菌介导法,对影响紫花苜蓿遗传转化体系的若干因素进行了研究。结果显示,6个栽培品种对卡那霉素敏感性不同,维多利亚为40 mg/L,而其他5个品种为50 mg/L;通过梯度实验表明：根癌农杆菌侵染浓度OD600为0.4~0.5,侵染时间为10~15 min,超声波处理时间为10 min是实现紫花苜蓿子叶转化及抗性愈伤组织形成较为有利的组合。卡那霉素抗性愈伤组织DNA的PCR扩增显示,转化体和质粒DNA分别扩增出长度大约为546 bp的清晰条带,初步表明耐盐SeNHX1基因已整合至紫花苜蓿愈伤组织中。     

甘蓝型油菜带节子叶再生体系的建立及遗传转化应用

优良再生体系的建立是农杆菌介导植物遗传转化的基础。本研究建立以甘蓝型油菜含部分子叶节的子叶为外植体的再生体系,该再生体系为:切取5日苗龄甘蓝型油菜含部分子叶节的带柄子叶为外植体,置于添加3 mg/L6-BA的MS基本培养基中培养5天,外植体再生出丛生不定芽,不定芽再生率为100%。基于新建立的带节子叶再生体系,通过农杆菌介导,成功地将用p FGC5941载体构建的Bn TFL1基因干扰载体转入甘蓝型油菜中,从播种到得到生根抗性苗,整个转化周期只需要60~70天,较传统甘蓝型油菜以不带节子叶为外植体100~130天的转化周期大大缩短。     

小麦农杆菌转化系统的建立与转基因植株的获得

针对农杆菌转化系统的诸多影响因素进行了系统研究，建立了有效的小麦农杆菌转化系统；利用石4185、石6365的花药愈伤组织为受体，进行了甜菜碱醛脱氢酶和胆碱氧化物酶等目的基因的转化研究。     

提高农杆菌介导的籼稻成熟胚愈伤组织再生频率研究

为了提高籼稻红莲型保持系粤泰B(YTB)成熟胚愈伤组织再生频率和遗传转化效率,利用培养基种类、菌液浓度、侵染方法、共培养方法、愈伤组织干燥处理方法、筛选剂浓度等6个方面设计农杆菌不同的培养条件进行试验。结果表明：LB和YEB培养基都可以作为农杆菌的培养方法;真空负压处理可以明显提高转化率;共培养时在共培养基上加滤纸有利于后续的除菌工作,能够提高转化效率;愈伤组织经过适当的干燥处理可以明显提高转化效率;适宜的潮霉素浓度在40~50 mg/L之间;采用V型筛选的方法,可以使转基因植株的阳性率有所提高。总之,通过对农杆菌培养条件的优化能有效地提高农杆菌介导的籼稻成熟胚愈伤组织再生频率。     

梨组织培养与遗传转化研究进展

为了总结梨组织培养和遗传转化方面的研究进展,为今后更好地开展梨遗传改良工作奠定基础,本研究分析了培养基类型、植物生长调节剂种类和浓度等对茎尖培养和叶片培养过程中各环节的影响,阐述了外植体的褐变原因及对策,归纳了目前梨遗传转化研究中导入的外源基因,分析了基因型、抗生素、农杆菌等因素对梨遗传转化效率的影响,最后总结了转基因植株的鉴定方法。在前人研究的基础上认为存在以下问题:(1)受基因型的限制,梨组织培养和遗传转化的范围还较窄;(2)农杆菌介导的遗传转化方法,转化频率不稳定;(3)与品质、抗性等相关的功能基因的遗传转化研究还不够深入。因此,今后需要建立高效稳定的再生和转化体系,开发更有效的遗传转化方法,并加快功能基因的研究,从而加速梨的遗传改良工作。     

辣椒子叶离体培养再生植株

随着收集到的８个商品辣椒品种的子叶外植体在ＰＤ培养基上形成芽丛，转移到ＰＥ培养基上伸长为具２－３个节的茎芽，茎芽在ＰＲ培养基上生根，得到了再生植株。芽分化率达１００％，移栽成活率１００％。多植体切除芽后回到ＰＤ培养基上的反复操作可重复诱导芽的分化，提高繁殖系数。     

小麦幼胚组织培养研究进展

小麦组织培养是利用基因工程改良小麦品种的重要基础和保证,小麦幼胚转化体系的建立对促进小麦基因工程研究和功能基因组研究具有重要的意义。以幼胚为外植体进行小麦组织培养的方法被大多数学者认为是最有效的培养方式。笔者就目前中国小麦幼胚组织培养研究现状,对品种、胚龄、培养基、外源激素、预处理、接种方式等研究现状进行了综述,目的是为了进一步建立和完善小麦幼胚再生体系和转化体系提高参考。