H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及免疫试验

为了更好防控H9N2亚型禽流感,且做到科学免疫,免疫减负.本研究采集疑似感染低致病禽流感鸡群病料,将其无菌处理后接种SPF鸡胚后进行病毒分离,通过分子生物学试验对其进行病原学鉴定.结果显示:分离鉴定出一株H9亚型禽流感病毒(AIV);血凝试验(HA)效价在10～11,该病毒属于欧亚分支的BJ亚分支.将病毒纯化后,制备灭...     

H9亚型禽流感病毒广西株的分离与鉴定

2010年5月,广西某肉鸡养殖场免疫传染性支气管炎、禽流感、新城疫疫苗的8500只黄羽肉鸡自22日龄开始出现死亡,5d内陆续死亡500多只,剖检发现支气管黏膜严重出血、支气管堵塞,充满淡黄色干酪样物质,肾脏肿大、有暗红色充血性坏死灶,初步怀疑为禽流感和新城疫病毒感染.我们采集典型病料,进行病毒分离、RT-PCR和动物回归试验等,最终确定该病毒为H9亚型禽流感病毒.     

3株H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

为了获得H9亚型禽流感病毒(AIV)流行毒株并掌握流行毒株的分子特征和致病性,采用病毒分离、血凝性试验、鸡胚半数感染量(EID50)测定、HA基因序列分析、致病性试验、交叉保护性试验等对3份临床疑似H9亚型AIV感染病料进行了研究.结果:3份临床病料样品可引起10日龄SPF鸡胚规律性死亡,3株分离毒株对1％鸡红细胞的凝...     

2株H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

本试验于广东省珠三角地区取样,接种SPF鸡胚纯化后分离到了2株禽流感病毒93株和101株,经过HA和HI试验鉴定均为H9亚型禽流感病毒阳性。对其HA基因进行分析后发现,此两株H9亚型禽流感病毒属于目前国内流行的H9.4.2.5分支,与近年来国内的流行毒株的核苷酸和氨基酸同源性较高。但是,其序列与国内常用的疫苗株F株SS株和SD696株存在差异,同源性较低。分子特征分析发现此2株病毒对人类受体的结合能力增强,潜在糖基化位点分布发生了改变。本试验结果证明H9毒株正在持续地进化,值得我们进一步地关注。     

一株H9亚型禽流感病毒的分离鉴定及生物特性研究

2013年中国吉林某养鸡场发生疑似H9亚型禽流感疫情,采集该发病鸡场病料接种9日龄SPF鸡胚,分离得到一株病毒。经血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验、测序分析,鉴定该毒株为H9亚型禽流感病毒(AIV)。对本试验分离株HA基因进行测序及序列分析,结果显示分离株HA基因的裂解位点为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV的基因特征;HA肽链具有9个潜在糖基化位点,与近些年H9亚型AIV分离株的潜在糖基化位点相同;具有8个受体结合位点,其中234位受体结合位点由谷氨酰胺(Q)变异成苏氨酸(T);HA基因系统进化树结果显示本试验分离株属于欧亚进化分支,与中国最早分离株A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)亲缘关系较远,与2007年后中国H9亚型AIV主要流行分支的代表株A/Chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)亲缘关系较近。将该毒株制成油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后第21天免疫鸡血清抗体高达10log2,表明本试验分离株具有很好的免疫原性。     

江西地区H9亚型禽流感病毒WS-JX株的分离鉴定

在江西某鸡场取样,接种SPF鸡胚后获得1株病毒WS-JX株,经HA和HI检测为H9亚型禽流感病毒阳性。通过HA基因分析,结果显示,WS-JX株HA基因核苷酸序列和氨基酸序列均与近年来国内流行的GX55等4.2.5分支H9亚型禽流感病毒相似性高,分别为90.1%～99.6%和94.1%～100.0%。而与国内常用的疫苗株F株、SS株等4.2.3分支病毒相似性较低,分别为85.9%～89.1%和90.6%～90.9%。试验结果表明,WS-JX分离株属于4.2.5分支,与近年来国内H9流行株类似,而与常用的疫苗株存在一定的差异。     

H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

2012年10月,在江苏省已进行过禽流感疫苗免疫的某肉鸡养殖基地,出现了一种以严重呼吸障碍、气管栓塞、突发死亡为特征的疾病。取典型病例鸡脑、肺脏、脾脏、咽拭子和泄殖腔拭子,经过初步处理后,接种于9日龄SPF鸡胚,经过培养纯化,获得一株病毒。通过血凝试验、血凝抑制试验和分子生物学试验以及动物回归试验等研究,最终确诊该病为H9亚型禽流感,分离的病毒为H9亚型禽流感病毒。     

一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从福州市某活禽市场采集的鸡泄殖腔棉拭子样品中分离出1株病毒,经血凝抑制试验(HI)和聚合酶链反应(PCR)方法鉴定为H9N2亚型禽流感病毒。在GenBank基因库中对该病毒株的3个基因片段的测序结果进行BLAST比对分析表明,3个基因片段均属于H9N2亚型禽流感病毒的基因。HA基因遗传进化分析表明,该病毒分离株与代表株DK/HK/Y280/97处于同一分支,与上海的鸡源分离株A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)同源性最高,同源性为99.5%。     

一株H9N2亚型禽流感病毒(YB株)的分离鉴定

禽流感(Avian Influence,AI)是由正粘病毒科、流感病毒属A型流感病毒引起的、主要以禽类感染为主的疾病综合征。禽流感分为高致病性禽流感和低致病性禽流感,高致病性禽流感引起家禽高发病率及死亡率,而低致病性禽流感则导致家禽出现呼吸道症状、生长发育受阻及产蛋下降等,严重危害养禽业的健康发展。现世界各地都有特定的毒株引起的禽流感暴发和流行,目前我国禽流感的流行以低致病性     

广东珠三角地区H9亚型禽流感病毒HD株的分离鉴定

在广东珠三角地区某鸡场取样,接种SPF鸡胚后获得1株病毒HD株,经HA和HI检测为H9亚型禽流感病毒阳性。HA基因分析显示,HD株HA基因核苷酸序列和氨基酸序列均与近年来国内流行的GX55等4.2.5分支H9亚型禽流感病毒相似性高,分别为94.1%~97.6%和95.8%~98.2%,而与国内常用疫苗株F、SS、SD696等4.2.3分支病毒相似性较低,分别为88.9%~89.8%和91%~91.6%。试验表明HD分离株属于4.2.5分支,与近年来国内H9流行株类似,而与常用疫苗株存在一定差异。     

呼吸道病型H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

广东省某鸡场发生一起以严重呼吸困难症状、急性死亡为特征的病例,5 000羽122日龄清远麻鸡在一周内连续死亡400多羽。剖检后几乎所有病死鸡支气管充满干酪样物质,导致支气管严重阻塞,气管及支气管黏膜严重出血。病料接种SPF鸡胚绒毛尿囊膜获得一株病毒。通过AGP试验,该病毒能与禽流感标准阳性血清形成明显沉淀线;通过HA试验,该病毒能够凝集鸡红细胞,但此血凝现象不能被抗NDV血清、抗EDSV-76血清、抗H5亚型流感单因子血清、抗H7亚型流感单因子血清所抑制,而能被抗H9亚型禽流感单因子血清所抑制;进而通过RT-PCR方法,最终确诊该病毒为H9亚型禽流感病毒。动物回归试验,攻毒鸡表现与临床发病鸡一致的症状及病理变化,并能再次分离到该病毒。     

H9N2亚型鸡源禽流感病毒分离与鉴定

禽流感 (AI)又名真性鸡瘟或欧洲鸡瘟 ,是由正粘病毒科 A型流感病毒引起的一种传染病 ,是国际兽医局规定的 A类烈性传染病。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及其他野禽均可感染。我们从新乡市某蛋鸡场分离鉴定 1株低致病力的 H9N2亚型的禽流感病毒毒株 ,现报告如下。1　材料与方法1.1　材料　病料来自河南职业技术师范学院禽病研究所接诊检验的病、死鸡。禽流感 A型琼扩抗原、标准阳性血清以及抗 HA、NA分型血清购自中国农科院哈尔滨兽医研究所 ;抗新城疫 (ND)血清和抗减蛋综合征 (EDS- 76 )血清由本院禽病研究所提供。 SPF鸡胚和雏鸡购自…     

H9亚型禽流感病毒免疫层析快速检测试剂盒的研制及应用

利用胶体金免疫层析技术,在建立H9亚型禽流感病毒免疫层析检测方法的基础上组装成试剂盒.试剂盒由试纸卡,稀释液、样品管、塑料吸管、一次性手套及说明书组成.对试剂盒的特异性、敏感性、保存期和重复性等进行了测定.结果表明,试剂盒在室温可以保存6个月,4℃可以保存12个月;与HA试验相比特异性强、灵敏度高、重复性好,操作简单、方便、快捷,能在10 min内准确检测出样品中是否含有H9亚型禽流感病毒.先后制备了5批试剂盒,对武汉市及周边地区的鸡场共抽检498份样品,经病毒分离鉴定准确率达到100%.     

鸭源H9亚型禽流感病毒的分离及其生物学特性的研究

从南京某肉鸭养殖场用灭菌棉拭共采集肉鸭的泄殖腔样品20份,通过SPF鸡胚尿囊腔传代接种法分离到1株病毒。HA-HI试验表明:该病毒可凝集鸡红细胞,不能被ND、EDS-76阳性血清抑制,但能被H9阳性血清所抑制,为H9亚型AI。该分离株生物学特性研究结果表明,对鸡表现为弱致病性,而对鸭无致病性。能在小鼠体内良好的增殖,并且可引起发病和死亡。     

H9亚型禽流感病毒血凝素特异性单因子血清制备

为制备特异性的H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清,本研究分别将6株不同亚群的H9亚型AIV的血凝素(HA)基因以鸡偏嗜的密码子进行优化,经全基因合成插入高效真核表达载体pCAGGS中,构建的真核重组质粒转染293T细胞进行瞬时表达,间接免疫荧光试验结果表明,重组质粒中的HA目的基因获得表达.将重组质粒以200μg/只的剂量免疫1月龄SPF鸡,6周后采血分离血清.交叉微量血凝抑制试验结果表明,血凝抑制效价可达8 long2～12 log2,灵敏度高,与其他AIV亚型抗原无交叉反应,型特异性强.     

禽流感病毒H5N2亚型西藏株的分离鉴定与特性分析

从西藏地区病死鸡体内分离鉴定到1株H5N2亚型禽流感病毒,基因组序列测定与分析显示,此H5N2毒株可能是由H5NI和H9N22种亚型的病毒重配形成,其PB2、HA、NS片段与高致病性H5NI亚型高度同源,PBI、PA、NP、NA、M均与低致病性H9N2亚型亲缘关系相近。尽管HA蛋白切割位点有多个碱性氨基酸序列,但静脉接种指数只有0．59,表现为低致病力。     

禽流感病毒H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的制备和鉴定

以常规方法纯化H9亚型禽流感病毒，制备了两株分泌抗禽流感病毒H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞11A5和1182，其上清ELISA效价均为1：10^4，腹水效价为1：10^7和1：10^6，HI效价上清分别为8、7log2，腹水效价均为15log2。采用HI方法证明其对禽流感病毒H9亚型的特异性，通过Western blot方法证明两株单抗都针对H9亚型禽流感病毒HA1蛋白。     

H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的真核表达及抗原性的鉴定

目的:通过哺乳动物细胞表达出禽源H7N9流感表面HA蛋白,并鉴定其抗原性。方法:通过引物设计,利用融合PCR方法扩增得到H7N9禽流感HA基因,以p CAGGS为表达载体构建重组质粒p CAGGS-H7-thrombin。测序正确后将重组质粒转染293T细胞。经72 h后收获上清,通过镍柱和凝胶层析柱纯化后得到目的蛋白。Western blot和ELISA结果鉴定纯化的H7蛋白的抗原性。结果:293T细胞表达的上清经HisTrapTMHP纯化后过Superdex 200 10/300 GL分子筛,在洗脱体积达到11 m L左右出峰,由出峰位置判断其为H7三聚体。Western blot检测在60 ku左右有一条阳性条带,ELISA检测其对抗H7N9小鼠阳性血清有很高的反应值。试验成功表达禽流感病毒H7N9的H7蛋白,并且针对H7N9的阳性血清有较高的灵敏性,为进一步研究H7N9亚单位疫苗奠定了基础。