鸡毒支原体热休克蛋白GrpE粘附特性的鉴定

鸡毒支原体(MG)脂质相关蛋白(LAMPs)的粘附特性在感染宿主细胞中起重要的作用,本实验室前期利用快速蛋白液相色谱和质谱鉴定MG的grp E基因编码的GrpE蛋白为热休克蛋白。为进一步鉴定GrpE蛋白是否具有粘附特性,本研究通过原核表达MG株grp E基因,并利用表达纯化的重组蛋白GrpE(rGrpE)免疫BALB/c小鼠。制备抗GrpE的单克隆抗体(MAb)。通过亚细胞定位,结果显示GrpE定位于细胞表面。通过激光共聚焦显微镜观察到rGrpE对DF-1细胞具有明显的粘附作用,而且利用抗GrpE的MAb能够特异抑制MG膜蛋白对DF-1细胞的粘附。此外,夹心ELISA和流式细胞术试验结果也表明制备的MAb能够显著抑制MG膜蛋白对DF-1细胞的粘附,并呈剂量依赖关系。上述结果表明热休克蛋白GrpE是MG的一种新的具有粘附特性的蛋白。     

鸡毒支原体GroEL蛋白通过NF-κB信号通路诱导DF-1细胞释放IL-1β的研究

鸡毒支原体(MG)脂质相关膜蛋白(LAMPs)在刺激宿主细胞天然免疫中起重要作用,GroEL蛋白是本实验室前期利用质谱鉴定筛选出的LAMPS中的关键组分。为研究GroEL蛋白诱导宿主细胞炎性反应的信号通路,本研究通过原核表达系统表达出MG的GroEL蛋白,利用激光共聚焦试验、荧光定量PCR和western blot方法分别检测GroEL蛋白的粘附特性、p65入核、磷酸化水平及IL-1β分泌情况。激光共聚焦试验结果显示,GroEL蛋白能够黏附于DF-1细胞表面并刺激DF-1细胞中p65从胞浆转入细胞核;western blot检测显示GroEL蛋白能够激活NF-κB信号通路促进p65磷酸化水平提高;荧光定量PCR检测显示GroEL蛋白能够促进IL-1β释放,当NF-κB信号通路被抑制后,IL-1β的释放显著下降(p0.01)。本研究结果表明MG GroEL蛋白能够粘附于宿主细胞表面并通过激活NF-κB信号通路诱导宿主细胞IL-1β的释放,从而在炎症反应中发挥作用。本研究为深入研究MG致病机制提供了实验依据。     

Mycoplasma mycoides subsp. mycoides Ben-1株一个新的膜蛋白的特性研究

为研究Mycoplasma mycoides subsp.mycoides(Mmm)Ben-1弱毒疫苗传代致弱的机制,本研究通过比较Mmm Ben-1株和其兔体内传代致弱毒株Ben-470的全基因组序列,发现在Ben-470株中缺失了一个编码165个氨基酸(分子量约19 ku)的495 bp的假定蛋白基因,命名为p588,扩增该基因,并表达重组P588(rP588)蛋白,制备兔抗血清。经细菌膜蛋白不同组份的提取及western blot鉴定,结果显示P588是一种膜蛋白,并且rP588与CBPP国际标准血清呈阳性反应。通过激光共聚焦显微镜观察到rP588对牛肺细胞(EBL)具有明显的粘附作用,并且ELISA试验也证明该蛋白的这种粘附为特异性粘附。上述结果表明P588蛋白是Mmm Ben-1的一个粘附蛋白。     

TLR2介导鸡毒支原体脂质相关膜蛋白诱导DF-1细胞表达IL-1β的研究

Toll样受体2(TLR2)在鸡毒支原体(MG)诱导天然免疫反应机制中的作用尚未明确。为鉴定TLR2在MG脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导细胞表达IL-1β中的作用,本研究通过RT-PCR和ELISA方法检测LAMPs刺激后DF-1细胞中IL-1β的m RNA和蛋白水平,结果显示LAMPs可以诱导DF-1细胞分泌IL-1β,并确定最佳刺激时间为6 h,最佳刺激剂量为1μg/m L。此外,通过构建TLR2重组表达质粒p CMV-HA-TLR2,并将该质粒转染DF-1细胞进行过表达及通过抗体封闭TLR2的两种处理方式,处理后采用LAMPs刺激细胞。经检测显示:TLR2过表达处理组的IL-1βm RNA和蛋白水平显著升高,而抗体处理组的IL-1βm RNA和蛋白水平下调。结果表明,LAMPs能够与DF-1细胞膜上的TLR2受体结合,有效的诱导DF-1细胞表达并分泌IL-1β,而且IL-1β的释放可能与天然免疫系统的经典通路即NF-κB信号通路调控有关。本研究为阐述MG的致病机制提供相关实验依据。     

猪嗜血支原体OxaA基因的同义定点突变、克隆及在Vero细胞中的表达

为真核表达猪嗜血支原体(Mycoplasma suis)膜蛋白OxaA基因,本实验采用PCR技术扩增包含OxaA基因全长在内的1 561 bp序列,通过引物突变法对OxaA基因内部的两个编码蛋白障碍的碱基进行同义定点突变,应用Overlap PCR技术将3对引物扩增得到的OxaA片段进行拼接,获得能够正确翻译膜蛋白的OxaA基因序列,将鉴定正确的pVAX-OxaA重组质粒转染Vero细胞,应用IFA和western blot方法鉴定OxaA基因在Vero细胞中的表达.结果显示,突变的OxaA基因经Overlap PCR扩增获得长度为747 bp的基因片段,与GenBank中M.suis基因组的核苷酸序列同源性为98％,IFA检测OxaA基因在Vero细胞中获得瞬时表达,western blot分析表达蛋白的分子量为29 ku,具有较好的反应原性.本实验首次在真核细胞中表达了M.suis的QxaA基因,为M.suis基因疫苗的研究奠定了基础.     

柔嫩艾美耳球虫胱硫醚β合成酶基因克隆及在真核细胞中的表达

为构建柔嫩艾美耳球虫胱硫醚β合成酶(Eimeria tenella cystathionineβ-synthase,Et CBS)基因的真核重组表达质粒p Bi FC-VC155-Et CBS,利用RACE技术克隆了Et CBS基因的全长c DNA序列,对其编码的蛋白进行相关生物信息学分析。通过RT-PCR扩增含完整开放阅读框(open reading frame,ORF)的c DNA片段,将其与真核表达载体p Bi FC-VC155连接,经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,转染DF-1细胞,用免疫印迹和间接免疫荧光技术鉴定重组蛋白表达情况。结果显示,成功获得了Et CBS基因的全长c DNA序列,该基因全长2423 bp,ORF位于第201~2087 bp之间,编码629个氨基酸,编码蛋白的分子量约为68k Da。生物信息学分析发现该基因编码的蛋白不具有信号肽,也不存在跨膜结构。Western blot可见大小约为68 k Da的重组表达蛋白条带,间接免疫荧光实验显示在转染的DF-1细胞中能检测到绿色荧光。研究结果表明,本研究已成功获得了Et CBS基因的全长c DNA序列,成功构建了Et CBS基因含完整ORF的真核重组表达质粒,并在DF-1细胞中实现了表达,为深入研究Et CBS基因的功能奠定了基础。     

杏花鸡白细胞介素10(IL--10)基因的克隆及其表达分析

为研究杏花鸡白细胞介素10(IL-10)基因在抵抗鸡球虫病中的作用,应用PCR、基因克隆和测序等技术获得杏花鸡完整的IL-10基因CDS序列,进行杏花鸡IL-10基因CDS序列和核苷酸序列与其他物种间的同源性分析,比较在QM-7成肌细胞、鸡肠上皮细胞IEC、鸡巨噬细胞HD11和鸡成纤维细胞DF-1中IL-10基因的表达差异以及在不同肠道组织中IL-10的表达量差异。结果表明,完整地扩增了IL-10基因的完整CDS序列,发现了3个同义突变(162AG、180TC和303CT)。构建的发育树表明杏花鸡IL-10基因CDS序列和核苷酸序列与红色原鸡、鹌鹑、火鸡和珍珠鸡的同源性最高。IL-10在鸡肠上皮细胞的表达量最高,在盲肠扁桃体中表达量最高。球虫子孢子的入侵导致DF-1细胞和HD11细胞中的IL-10表达量升高。研究结果为IL-10基因在肠道免疫和抵抗球虫病的研究提供理论基础。     

太行鸡MC1R基因的克隆测序、表达及生物信息学分析

为研究影响太行鸡不同羽色性状的重要候选基因MC1R的表达及生物信息学特性,试验以太行鸡麻、白两种羽色为研究对象,采用PCR克隆、实时荧光定量PCR技术和生物信息学分析进行探讨。测序结果显示:太行鸡MC1R基因CDS序列为945 bp,编码蛋白为314个氨基酸;蛋白理化性质分析发现,MC1R蛋白存在7个跨膜区,为跨膜受体;CDS区序列比对发现,太行鸡MC1R基因存在c.637CT的突变,突变造成编码氨基酸mRNA二级结构和编码蛋白空间结构发生改变;实时荧光定量PCR检测发现,太行鸡麻羽品系毛囊中MC1R的表达量极显著高于白羽品系(P0.01)。研究结果表明:MC1R基因的c.637CT突变显著影响太行鸡的羽色,可以作为太行鸡羽色选育的候选分子标记。     

鸡膜联蛋白A2在DF-1细胞中的表达及亚细胞定位

根据GenBank已发表的鸡膜联蛋白A2(ANXA2)基因序列,设计合成一对特异性引物从DF-1细胞总RNA的反转录产物中扩增鸡ANXA2基因开放阅读框,通过酶切、连接等方法将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1,构建重组真核表达载体pEGFP-ANXA2。利用脂质体转染法将pEGFP-ANXA2转染至DF-1细胞,24 h后分别检测融合蛋白EGFP-ANXA2在细胞中的表达及亚细胞定位情况。结果显示:成功构建了鸡ANXA2基因的重组真核表达载体pEGFP-ANXA2;将其转染DF-1细胞后得到与预期大小相符的EGFP-ANXA2蛋白条带,荧光显微镜观察显示EGFP-ANXA2主要定位在细胞质。研究结果为进一步开展鸡ANXA2在相关家禽病毒复制中的作用研究奠定了基础。     

J、K亚群禽白血病病毒的分离和囊膜蛋白(gp85)基因序列分析

为了解现阶段我国禽白血病病毒(ALV)的流行特征和演化趋势,本试验于2021—2022年从国内某鸡场采集蛋清ALV衣壳蛋白(p27)抗原阳性的鸡血浆,接种鸡胚成纤维细胞(DF-1)分离病毒并进行亚群鉴定;采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增分离株的囊膜蛋白(gp85)基因片段,并对其进行测序,将基因序列与ALV不同亚群毒株进行比对和遗传进化分析;选取氨基酸变化差异较大的分离毒株进行间接免疫荧光鉴定。结果显示,共分离到7株ALV毒株(3株J亚群,4株K亚群),ALV-J分离毒株CAU4932、CAU4860和CAU2259的gp85基因片段长度为918 bp,编码306个氨基酸,分离毒株之间gp85基因核苷酸同源性为90.5%～95.2%,gp85蛋白氨基酸同源性为95.1%～99.3%;ALV-K分离毒株CAU7049、CAU5006、CAU7176和CAU7168的gp85基因片段长度为1 008 bp,编码336个氨基酸,分离毒株之间gp85基因核苷酸同源性为89.4%～92.3%,gp85蛋白氨基酸同源性为94.0%～99.7%。gp85蛋白氨基酸序列同源性比对发现,分离株gp8...