草鱼胰岛素样生长因子—I的融合表达、纯化和抗血清制备

采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子-I（IGF-I）cDNA。使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX-4T-1载体中,构建草鱼IGF-I融合蛋白表达质粒pGEX-IGF。质粒转化大肠杆菌BL21菌株,该菌株经IPTG诱导可表达分子量约34kD的特异蛋白。在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白,经30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后,裂解液上清经glutathione sepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST-IGF。以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF-I的抗血清,凝胶双扩散试验显示抗血清效价为1：64,说明表达产物具免疫原性。     

草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ的融合表达、纯化和抗血清制备

采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA,使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX-4T-1载体中,构建草鱼IGF-Ⅰ融合蛋白表达质粒pGEX-IGF.质粒转化大肠杆菌BL21菌株.该菌株经IPTG诱导可表达分子量约34kD的特异蛋白.在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白.经30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后,裂解液上清经glutathionesepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST-IGF.以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF-Ⅰ的抗血清.凝胶双扩散试验显示抗血清效价为1:64,说明表达产物具免疫原性.     

哲罗鲑胰岛素样生长因子-I的原核表达及活性鉴定

为进一步了解哲罗鲑IGF-I,实验采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从哲罗鲑肝脏的总RNA中扩增出胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的c DNA开放阅读框(open reading frame,ORF)序列。利用原核表达载体p S构建重组表达质粒(IGF-I/p S),并将其转化到宿主大肠杆菌Rosetta后经IPTG诱导获得重组哲罗鲑IGF-I蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,在35~50 ku有条带与预期相符,且重组蛋白以包涵体的形式存在。包涵体经变性/复性实验后,获得纯化的IGF-I融合蛋白。ELISA鉴定结果显示,目的蛋白能特异性识别抗鱼类IGF-I抗体,表明获得了具有免疫活性的哲罗鲑IGF-I蛋白。细胞增殖实验(MTT法)结果显示,重组IGF-I蛋白对大麻哈鱼胚胎细胞(CHSE-214)、鲤上皮细胞(EPC)及虹鳟性腺细胞(RTG-2)均有显著促增殖作用,表明获得的重组IGF-I蛋白具有细胞水平的生物活性。本研究为深入了解IGF-I在哲罗鲑生长发育中的调控机制及绿色高效促生长制剂的研发奠定基础。     

草鱼胰岛素样生长因子_基因克隆及序列分析

采用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,从草鱼肝脏的总ＲＮＡ中扩增出胰岛素样生长因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）基因序列,定向克隆至质粒pUC18,测宇了该基因序列,推导期编码的蛋白序列,克隆的cDNA序列编码包括Ｂ,Ｃ,Ａ,Ｄ和Ｅ五个区域的１７个氨基酸,与鲤ＩＧＦ－Ｉ成熟肽比较,核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为９３．８％和９７．１％,E区域分析结果表明,所克隆的草鱼ＩＧＦ－Ｉ序列属于ＩＧＦ－ＩＥa-2亚型。     

大菱鲆胰岛素样生长因子-I成熟肽的克隆、重组表达及活性分析

通过RT-PCR方法从大菱鲆肝组织克隆了胰岛素样生长因子-I(IGF-I)成熟肽片段,分析表明,此成熟肽由70个氨基酸残基组成,含有3个链内二硫键。将扩增片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,实现了IGF-I成熟肽和GST蛋白在Escherichia coli BL21(DE3)plysS中的融合表达。融合蛋白分子量约为34ku,诱导4h时占菌体总蛋白的59%,主要以包涵体形式存在。Western-blotting免疫印迹表明,融合蛋白可以特异性地被anti-GST抗体识别。包涵体经6mol/L盐酸胍变性溶解及脉冲法稀释复性后,通过GSTrapFF亲和预装柱纯化,获得了电泳分析纯的融合蛋白。以细胞增殖实验检测蛋白生物活性,结果显示,纯化蛋白能促进大菱鲆肾脏细胞的增殖。     

鲤胰岛素样生长因子Ⅱ的克隆表达与抗体制备

从鲤(Cyprinus carpio)肝脏总RNA中成功地克隆和诱导表达了胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)基因,并用间接ELISA法和Western-blot对其融合蛋白的多克隆抗体的效价和特异性进行了分析。结果表明,克隆的鲤IGF-Ⅱ基因与已报道的序列相比,有1个位点发生同义突变;经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,表达量占菌体总量的35%。经ELISA测定,制备的抗体效价为6400。Western blot分析表明,抗血清能与重组蛋白发生特异性反应     

草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果

为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm,60～120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫注射第21天人工接种GCRV,免疫后的草鱼对出血病的保护力达100%。     

胰岛素样生长因子与动物性状的相关性研究

胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactors,IGFs)是生长激素促生长作用的主要介导因子,通过对IGF-I和IGF-II及其对动物相关性状影响的系统分析,进一步揭示了其在动物的生长发育过程中发挥的重要作用。     

胰岛素样生长因子与动物性状的相关性研究

胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGFs）是生长激素促生长作用的主要介导因子，通过对IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ及其对动物相关性状影响的系统分析，进一步揭示了其在动物的生长发育过程中发挥的重要作用。     

草鱼FGF8蛋白的理化特性分析

Physico-chemical properties of FGF8 in Ctenopharyngodon idellus were analyzed by bioinformatics. The full - length grass carp FGF8 pro-polypeptide of 210 amino acids including 40 basic amino acids and 16 acidic amino acids. The signal peptide sequence is MRLIPSRLSYLFLHLFAFCYYA, and its cleavage site is located between Ala22 and Gln23. Grass carp FGF8 protein is a secreted protein since the typical character of secreted protein is that its N-domain contains a signal peptide. There are two N-glycosylation in the sites of Asn37 and Asn136, respectively, which were Asn-Phe-Thr and Asn-Tyr-Thr. The molecular weight （Mw） of grass carp FGF8 protein is 24.68 kDa. Its isoelectnic point （pl） is 10.93. The protein contains four main secondary structures： α-helix, β- sheet, β-turn and random coil.     

草鱼幼鱼对烟酸需要量

草鱼幼鱼的初始体重为12.43±0.80g,试验分为7组,其饲料中烟酸含量分别为5.1、9.8、16.6、32.2、66.7、130.1、271.5 mg•kg-1,每组设3个重复,每桶30尾鱼,日投喂率2％～3％,饲养试验周期为8周。研究不同含量烟酸对草鱼幼鱼生长性能、饲料系数、机体营养组分、造血功能及血脂的影响,以确定草鱼幼鱼饲料中适宜烟酸需要量。试验结果表明：1.添加烟酸显著提高了特定生长率、增重率和草鱼幼鱼的存活率,对草鱼幼鱼肥满度无显著影响;烟酸含量为32.2 mg•kg-1时草鱼的特定生长率和增重率最大,饲料系数最低,并与其它各组存在显著差异;2.添加烟酸对草鱼全鱼水分、灰分无显著影响,显著提高了全鱼粗脂肪含量,但各添加组间无显著差异;饲料中烟酸含量为66.7mg•kg-1时,粗蛋白显著高于对照组及9.8 mg•kg-1组;3.添加烟酸显著提高了血液红细胞计数和血红蛋白含量,但对血清胆固醇和甘油三酯无显著影响,烟酸含量为16.6 mg•kg-1及以上时显著提高血清高密度脂蛋白胆固醇与低密度脂蛋白胆固醇,与对照组和9.8 mg•kg-1组存在显著差异。基于折线法分析,草鱼幼鱼获得最佳生长时的饲料中烟酸最低需求量为25.5 mg•kg-1。 关键词：草鱼;烟酸;生长;需要量     

饲料中添加3种免疫增强剂对草鱼生长和非特异性免疫力的影响

本试验以草鱼为实验对象,利用L9（34）正交表,通过正交试验设计初步研究壳寡糖、黄芪多糖和益生素对草鱼生长性能、生理指标和免疫功能的影响。实验结果表明：以存活率和特定生长率为考察指标,以壳寡糖影响程度最大,但3种免疫增强剂的影响程度不显著。以碱性磷酸酶为考察指标,影响程度的排序为壳寡糖〉益生素〉黄芪多糖,壳寡糖最适水平为为0.6‰,平均值最高为8.967,与其它两个水平差异显著（Sig.〈0.05）,不同水平的黄芪多糖和益生素对草鱼碱性磷酸酶活性影响均不显著。因此壳寡糖比较适合用作草鱼的免疫增强剂。     

草鱼免疫球蛋白M重链基因的克隆及表达

用RACE-PCR方法扩增出草鱼免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM) 分泌型的重链全长cDNA.其cDNA全长为1 940 nt,包含5'非编码区20 nt,3'非编码区189 nt,开放阅读框1 731 nt,编码576个氨基酸.序列比对分析表明草鱼IgM与鲤的相似性高达68%,与斑马鱼、斑点叉尾鱼回、鳜以及大西洋鳕的相似性分别为61%、43%、33%和30%.ClustalX比对结果显示:草鱼IgM中存在半胱氨酸和色氨酸的保守位点.进化分析表明,草鱼IgM与斑马鱼的IgM聚为一枝.荧光定量PCR显示草鱼IgM的mRNA主要在头肾、中肾和脾脏中表达,表明了这三个免疫器官是IgM表达的主要场所.     

氨对草鱼生长的危害

氨对草鱼生长的危害朱耘，吴圣杰，华丹（中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，无锡２１４０８１）关键词氨，草鱼，生长ＴＨＥＨＡＲＭＦＵＬＥＦＦＥＣＴＯＦＴＨＥＡＭＭＯＮＩＡＯＮＴＨＥＧＲＯＷＴＨＯＦＧＲＡＳＳＣＡＲＰ（ＣＴＥＮＯＰＨＡＲＹＮＧＯＤＯＮＩＤ...     

草鱼APN基因的克隆及表达特征

氨肽酶N(APN)是肽酶M1家族的成员之一,在蛋白质的消化中发挥重要作用。采用同源克隆和RACE技术首次克隆草鱼APN基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为3258bp,包含27bp的5UTR序列,552bp的3UTR序列,2679bp开放阅读框,编码892个氨基酸;草鱼与斑马鱼基因同源性和编码氨基酸同源性分别为81.5%和75.4%,与其他动物同源性分别为58.8%～61.2%和54.3%～60.2%。经预测,其编码蛋白的分子量为100.61ku,等电点为5.14,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的1个螺旋跨膜结构,但跨膜区氨基酸同源性较低;系统进化分析表明,草鱼APN基因与斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-timePCR技术检测了该基因的发育表达,结果显示草鱼出膜4d后APNmRNA表达量相对稳定;APN在草鱼前肠、中肠和后肠均有较高的表达量,以前肠组织表达量最高;昼夜节律研究发现,肠道APN基因06:00-18:00的表达量较18:00-06:00高。     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)成纤维细胞生长因子8的cDNA克隆及特征分析

以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为实验对象,利用RACE技术克隆了草鱼成纤维细胞成长因子8(Fibro-blast Growth Factor8,FGF8)cDNA序列。实验结果显示,草鱼FGF8 cDNA序列长度为887 bp,其中5′-非翻译区长100 bp,3′-非翻译区长157 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,编码210个氨基酸的前体蛋白,包含22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。利用已知的FGF8序列绘制系统发育树,发现草鱼与两种鲤科鱼(班马鱼、墨西哥脂鲤)聚为一簇,显示亲缘关系很近,而与其它脊椎动物如两栖类、鸟类、哺乳类的亲缘关系则相对较远,这与形态分类学的结果一致。此外,还通过生物信息学分析,揭示了草鱼FGF8的分子结构特征。