草鱼胰岛素样生长因子—I的融合表达、纯化和抗血清制备

采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子-I（IGF-I）cDNA。使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX-4T-1载体中,构建草鱼IGF-I融合蛋白表达质粒pGEX-IGF。质粒转化大肠杆菌BL21菌株,该菌株经IPTG诱导可表达分子量约34kD的特异蛋白。在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白,经30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后,裂解液上清经glutathione sepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST-IGF。以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF-I的抗血清,凝胶双扩散试验显示抗血清效价为1：64,说明表达产物具免疫原性。     

草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ的融合表达、纯化和抗血清制备

采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA,使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX-4T-1载体中,构建草鱼IGF-Ⅰ融合蛋白表达质粒pGEX-IGF.质粒转化大肠杆菌BL21菌株.该菌株经IPTG诱导可表达分子量约34kD的特异蛋白.在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白.经30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后,裂解液上清经glutathionesepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST-IGF.以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF-Ⅰ的抗血清.凝胶双扩散试验显示抗血清效价为1:64,说明表达产物具免疫原性.     

哲罗鲑胰岛素样生长因子-I的原核表达及活性鉴定

为进一步了解哲罗鲑IGF-I,实验采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从哲罗鲑肝脏的总RNA中扩增出胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的c DNA开放阅读框(open reading frame,ORF)序列。利用原核表达载体p S构建重组表达质粒(IGF-I/p S),并将其转化到宿主大肠杆菌Rosetta后经IPTG诱导获得重组哲罗鲑IGF-I蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,在35~50 ku有条带与预期相符,且重组蛋白以包涵体的形式存在。包涵体经变性/复性实验后,获得纯化的IGF-I融合蛋白。ELISA鉴定结果显示,目的蛋白能特异性识别抗鱼类IGF-I抗体,表明获得了具有免疫活性的哲罗鲑IGF-I蛋白。细胞增殖实验(MTT法)结果显示,重组IGF-I蛋白对大麻哈鱼胚胎细胞(CHSE-214)、鲤上皮细胞(EPC)及虹鳟性腺细胞(RTG-2)均有显著促增殖作用,表明获得的重组IGF-I蛋白具有细胞水平的生物活性。本研究为深入了解IGF-I在哲罗鲑生长发育中的调控机制及绿色高效促生长制剂的研发奠定基础。     

草鱼胰岛素样生长因子_基因克隆及序列分析

采用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,从草鱼肝脏的总ＲＮＡ中扩增出胰岛素样生长因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）基因序列,定向克隆至质粒pUC18,测宇了该基因序列,推导期编码的蛋白序列,克隆的cDNA序列编码包括Ｂ,Ｃ,Ａ,Ｄ和Ｅ五个区域的１７个氨基酸,与鲤ＩＧＦ－Ｉ成熟肽比较,核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为９３．８％和９７．１％,E区域分析结果表明,所克隆的草鱼ＩＧＦ－Ｉ序列属于ＩＧＦ－ＩＥa-2亚型。     

大菱鲆胰岛素样生长因子-I成熟肽的克隆、重组表达及活性分析

通过RT-PCR方法从大菱鲆肝组织克隆了胰岛素样生长因子-I(IGF-I)成熟肽片段,分析表明,此成熟肽由70个氨基酸残基组成,含有3个链内二硫键。将扩增片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,实现了IGF-I成熟肽和GST蛋白在Escherichia coli BL21(DE3)plysS中的融合表达。融合蛋白分子量约为34ku,诱导4h时占菌体总蛋白的59%,主要以包涵体形式存在。Western-blotting免疫印迹表明,融合蛋白可以特异性地被anti-GST抗体识别。包涵体经6mol/L盐酸胍变性溶解及脉冲法稀释复性后,通过GSTrapFF亲和预装柱纯化,获得了电泳分析纯的融合蛋白。以细胞增殖实验检测蛋白生物活性,结果显示,纯化蛋白能促进大菱鲆肾脏细胞的增殖。     

鲤胰岛素样生长因子Ⅱ的克隆表达与抗体制备

从鲤(Cyprinus carpio)肝脏总RNA中成功地克隆和诱导表达了胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)基因,并用间接ELISA法和Western-blot对其融合蛋白的多克隆抗体的效价和特异性进行了分析。结果表明,克隆的鲤IGF-Ⅱ基因与已报道的序列相比,有1个位点发生同义突变;经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,表达量占菌体总量的35%。经ELISA测定,制备的抗体效价为6400。Western blot分析表明,抗血清能与重组蛋白发生特异性反应     

草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果

为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm,60～120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫注射第21天人工接种GCRV,免疫后的草鱼对出血病的保护力达100%。     

胰岛素样生长因子与动物性状的相关性研究

胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactors,IGFs)是生长激素促生长作用的主要介导因子,通过对IGF-I和IGF-II及其对动物相关性状影响的系统分析,进一步揭示了其在动物的生长发育过程中发挥的重要作用。     

胰岛素样生长因子与动物性状的相关性研究

胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGFs）是生长激素促生长作用的主要介导因子，通过对IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ及其对动物相关性状影响的系统分析，进一步揭示了其在动物的生长发育过程中发挥的重要作用。     

草鱼FGF8蛋白的理化特性分析

Physico-chemical properties of FGF8 in Ctenopharyngodon idellus were analyzed by bioinformatics. The full - length grass carp FGF8 pro-polypeptide of 210 amino acids including 40 basic amino acids and 16 acidic amino acids. The signal peptide sequence is MRLIPSRLSYLFLHLFAFCYYA, and its cleavage site is located between Ala22 and Gln23. Grass carp FGF8 protein is a secreted protein since the typical character of secreted protein is that its N-domain contains a signal peptide. There are two N-glycosylation in the sites of Asn37 and Asn136, respectively, which were Asn-Phe-Thr and Asn-Tyr-Thr. The molecular weight （Mw） of grass carp FGF8 protein is 24.68 kDa. Its isoelectnic point （pl） is 10.93. The protein contains four main secondary structures： α-helix, β- sheet, β-turn and random coil.     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)成纤维细胞生长因子8的cDNA克隆及特征分析

以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为实验对象,利用RACE技术克隆了草鱼成纤维细胞成长因子8(Fibro-blast Growth Factor8,FGF8)cDNA序列。实验结果显示,草鱼FGF8 cDNA序列长度为887 bp,其中5′-非翻译区长100 bp,3′-非翻译区长157 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,编码210个氨基酸的前体蛋白,包含22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。利用已知的FGF8序列绘制系统发育树,发现草鱼与两种鲤科鱼(班马鱼、墨西哥脂鲤)聚为一簇,显示亲缘关系很近,而与其它脊椎动物如两栖类、鸟类、哺乳类的亲缘关系则相对较远,这与形态分类学的结果一致。此外,还通过生物信息学分析,揭示了草鱼FGF8的分子结构特征。     

草鱼肠道芽孢杆菌的鉴定及产酶能力分析

从100 g左右的健康草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道中分离出3株疑似芽孢杆菌(Bacillus)菌株(G1、G2、G3),并通过对其进行生理生化特征、16S rDNA全序列和产酶能力的分析,筛选出1株高产酶能力的益生菌株.结果显示:G1、G2和G3菌株与枯草芽孢杆菌在16S rDNA序列相似性≥99％的水平上聚为同一分支,结合形态观察和生理生化特征,最终鉴定G1、G2和G3菌株均为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);以水解圈直径/菌落直径比值评定了G1、G2和G3菌株的产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶的能力,其中G1菌株产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶能力(比值分别为2.9、2.2和3.3)均高于G2、G3菌株,具有作为益生菌的潜力.     

草鱼贮藏过程中导电特性变化规律的研究

运用物理特性-伏安法测定了不同频率下冰鲜和解冻草鱼的阻抗,分析在不同贮藏时间下阻抗的相对变化值(Q值)的变化特点。结果显示:从1 kHz增大到10 kHz,冰鲜和解冻草鱼的阻抗均随着频率的增大而减小,冰鲜草鱼的阻抗相对变化值(Q值)明显大于解冻草鱼。冰鲜草鱼在第1、2、4、7、10天的阻抗相对变化Q值分别为:28.89%、25.10%、17.01%、11.65%、10.37%,而冷冻7、14、30 d后解冻草鱼的最大Q值分别为4.34%、4.18%、4.63%。结果表明:以Q值10%为界限,快速鉴定冰鲜草鱼和解冻草鱼是基本可行的。     

亚硝酸盐对草鱼红细胞渗透脆性的影响

研究不同浓度亚硝酸盐(0.5、1.0、2.0 mg/L)及不同处理时间(24、72、120、168、264 h)对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)红细胞渗透脆性的影响.结果表明:与对照组比较,实验各组草鱼红细胞脆性最小抵抗值、最大抵抗值极显著升高(P＜0.01); 2.0 mg/L浓度组红细胞渗...     

生态基挂设密度对草鱼生长性能和血清酶活性的影响

试验按生态基表面积占水泥池水体表面积比值(比表面积),设置50%(S-50)、100%(S-100)、150%(S-150)和对照组(无生态基)四个试验组,研究生态基挂设密度对草鱼生长性能和血清酶活性的影响。结果显示,S-100和S-150处理组草鱼的末重、增重率及特定生长率无显著差异,但均显著高于对照组和S-50组,饲料转化率均显著低于对照组,S-100处理组存活率显著高于其它处理组。S-100组水体COD含量显著低于对照组的,附着生物量(VSS)显著高于其它处理组。S-100与S-150组的过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性均无显著差异,但均显著低于对照组和S-50组。试验组谷草转氨酶活性(AST)显著低于对照组。结果表明,生态基挂设密度影响草鱼的生长及其血清酶活性,挂设密度过高抑制微生物的附着生长,但超过100%的生态基挂设密度在一定程度上可能促进草鱼机体内的活性氧自由基代谢平衡,增强机体的抗氧化能力,促进草鱼生长。在本试验条件下,当挂设生态基的表面积占池塘水体表面积比值(比表面积)100%时,不仅可显著促进草鱼生长,提高养殖产量,降低饵料系数,而且能有效减少生态基使用量,进而降低生产成本。     

铜和镉对草鱼肾脏中3种白细胞介素基因表达的影响

为探讨水体铜(Cu)和镉(Cd)污染对草鱼免疫系统的影响,本研究利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)技术,分析在不同时间(2、4、6、8 d)及不同质量浓度的Cu²⁺(0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mg/L)和Cd²⁺(0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/L)暴露下,草鱼肾脏中3种白细胞介素——白细胞介素-1β、白细胞介素-8和白细胞介素-10基因表达量的变化。试验结果显示,高质量浓度和长时间的Cu²⁺暴露(0.60、0.80 mg/L, 8 d)和Cd²⁺暴露(0.20、0.30、0.40 mg/L, 8 d)下,草鱼肾脏中的白细胞介素-1β、白细胞介素-8和白细胞介素-10基因表达量与对照组相比显著增加(P<0.05);在0.80 mg/L Cu²⁺,0.30、0.40 mg/L Cd²⁺暴露下的草鱼肾脏中白细胞介素-1β的基因表达量,以及在0.60、0.80 mg/L Cu²⁺暴露下的草鱼肾脏中白细胞介素-8和白细胞介素-10的基因表达量,均随着暴露时间的增加而逐渐升高,且第8 d时的基因表达量均显著高于第2 d时(P<0.05)。本研究揭示了高质量浓度和长时间的Cu²⁺、Cd²⁺暴露会使草鱼肾脏产生炎症反应,为进一步深入研究重金属对鱼类的免疫毒性机制奠定了基础。     

复方中草药对草鱼生长和血细胞数量的影响

选取400尾草鱼,平均体质量(62.15±9.78)g,随机分成4组,每组100尾鱼,其中1个对照组(投喂基础饲料),3个试验组[投喂复方中草药:基础饲料中分别添加2%(20g/kg)复方中草药Ⅰ(T1)、Ⅱ(T2)和Ⅲ(T3)]。每组分别在第0、7、14、21、28d采样,进行红细胞及白细胞计数和白细胞分类计数,且在第28d时测定肥满度和内脏指数。在第0、30d时称量质量测定生长指标。试验结果表明,饲养30d后,T1组、T2组、T3组的平均质量增加率分别比对照组提高了41.77%、90.38%和8.56%;在第14d,各试验组的单核细胞百分比极显著高于对照组(P0.01),14～21d,T2组在各试验组中淋巴细胞分类计数值最大。所以,在基础饲料中添加2%复方中草药Ⅱ可显著提高草鱼的生长性能和免疫力(P0.05),在3种试验复方中效果最佳,在生产中具有应用价值。