光皮桦EST-SSR PCR反应体系的优化

为获得稳定的聚合酶链式反应（PCR）产物,采用正交设计L25（56）对光皮桦Betula luminifera表达序列标签-简单重复序列聚合酶链式反应（EST-SSR PCR）反应体系中的5个因素:DNA模板浓度,引物浓度,镁离子（Mg2+）浓度,三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度和DNA聚合酶量进行优化,每个因素设计5个水平。优化试验结果表明:光皮桦EST-SSR最佳PCR反应体系:4.0 mgL－1DNA模板,0.500 molL－1引物,1.250 mmolL－1 Mg2+,0.250 mmolL－1 dNTPs,0.072 5 16.67 mkatL－1 rTaq酶。通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。对优化出的EST-SSR PCR反应体系进行稳定性检测,结果均能获得稳定、清晰可辨的DNA谱带。图6表3参15     

光皮桦SSR分子标记体系的建立

采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）-硅珠法提取光皮桦Betula luminifera嫩叶DNA,利用近缘种日本白桦B. platyphylla var. japonica和欧洲白桦B. pendula的引物,建立光皮桦简单重复序列标记（SSR）反应体系。在体系建立过程中,采用单因素法分别对影响聚合酶链式反应（PCR）反应的因素进行分析。结果表明：在20 μL反应体系中,模板DNA用量、Mg²⁺浓度、脱氧核糖核苷酸（dNTPs）浓度、引物浓度、T_aq DNA聚合酶用量分别为60 ng,1.500 mmol·L^－1,0.175 mmol·L^－1,2.500 mmol·L^－1,1.0 × 16.67 nkat时结果最好;引物退火温度比日本白桦扩增时提高1 ℃时效果佳。PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后随机挑取其中3对引物扩增的多态性片段进行克隆测序,对引物的通用性做进一步检验,序列经比对后得到的与原物种序列相似度（max ident值）均在95.0%以上。可见,近缘种日本白桦和欧洲白桦的SSR引物可以在光皮桦上应用。图7表2参17     

光皮桦BlFTL基因的克隆和表达模式

通过反转录-聚合酶链式反应（RT?鄄PCR）结合如cDNA末端快速克隆（RACE）技术从光皮桦Betula luminifera中克隆到1个FT类似基因,命名为BlFTL。该基因cDNA全长为924 bp（GenBank登录号:JQ951966）,包含1个525 bp的开放阅读框（116~640 bp）,编码1个含174个氨基酸的蛋白,且具有FT蛋白典型的磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）结构域。与已有部分植物中FT蛋白同源比对结果显示,BlFTL与无花果Ficus carica中FcFT序列相似性最高,达到了94%。4月为光皮桦开花期,雌花中BlFTL基因的表达量最高,茎和叶片中表达量很低。比较正常开花和不开花无性系植株嫩茎和叶片在不同时间BlFTL基因的表达情况,结果表明:BlFTL在不开花无性系植株中基本不表达,而正常开花植株中,BlFTL主要在雌花序和混合芽形成的8月以后表达。图8参13     

光皮桦成花相关MADS-box基因BlMADS1的克隆与表达

MADS-box家族基因广泛分布于植物中,在花发育过程中起着重要调控作用。采用同源克隆结合c DNA末端快速扩增技术(RACE)在光皮桦Betula luminifera中克隆到1个MADS-box基因,命名为Bl MADS1。该基因可能存在2个不同的转录本Bl MADS1S和Bl MADS1L:前者为1 150 bp,编码254个氨基酸,具有MADS-box基因的典型结构,与欧洲白桦Betula pendula的同源基因相似性最高(97%);后者长1 312 bp,但仅含有690 bp的开放阅读框(ORF),编码229个氨基酸,缺失MADS-box蛋白的C端。这种缺失可能由内含子可变剪切造成。同源比对和系统进化分析表明:Bl MADS1属于AP1/SQUA亚家族的AGL79这一分支。定量聚合酶链式反应(PCR)表达分析表明:Bl MADS1基因在根、茎、叶和花器官中均有表达,但Bl MADS1S和Bl MADS1L这2个转录本表达模式存在差异。雄花序发育过程中,Bl MADS1的2个转录本的表达峰值均在萌动雄花序时期;而在雌花序发育过程中,Bl MADS1L和Bl MADS1S表达水平的峰值分别出现在初生雌花芽和萌动雌花序。图6表1参27     

光皮桦叶片再生体系的建立

【目的】建立光皮桦叶片高效再生体系,为光皮桦的良种培育及遗传转化研究提供依据。【方法】以光皮桦无菌叶片为外殖体,分别用含0.6 mg/L TDZ 的MS、WPM和1/2MS培养基进行不定芽诱导分化,筛选最佳基本培养基;向筛选出的最佳基本培养基中添加0.05 mg/L NAA及不同质量浓度（0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mg/L）TDZ的激素组合组成不定芽分化培养基,用于诱导不定芽分化,筛选最佳不定芽诱导分化培养基;以1/2MS培养基为基本培养基,分别附加0,0.05,0.1,0.5,1.0,2.0 mg/L的IBA或0.5,1.0,2.0,3.0 mg/L的NAA组成生根培养基,用于再生苗生根,筛选最佳生根培养基,建立光皮桦叶片再生体系。【结果】光皮桦无菌叶片诱导不定芽的最适基本培养基为MS培养基,其诱导的不定芽最多,且芽生长状况良好,颜色深绿;最适不定芽诱导分化培养基为：MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂5.5 g/L,在该培养基上叶片丛生芽诱导率可达到80.00%,平均不定芽数高达12.00个,且芽生长健壮,呈深绿色;最适再生苗生根培养基为：1/2MS+IBA 1.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂5.5 g/L,在该培养基上再生苗的生根率达100%,平均根数为14.5个,平均根长为11 cm,根较粗壮,基部无愈伤组织,且产生了很多毛细根。【结论】建立了光皮桦无菌苗叶片的高效再生体系。     

银杏ISSR-PCR扩增反应体系的优化

为了对影响银杏戗ngkobiloba简单序列重复区间扩增-聚合酶链式反应（ISSR-PCR）扩增反应体系的因素进行优化,采用[SSR-PCR扩增技术和UVP凝胶电泳成像技术对模扳DNA浓度、Taq酶用量、引物用量、dNTP的用量以及退火温度等因素进行筛选和优化筛选优化后的反应条件：Taq酶0．3μg,2μL10×Buffer（含15mmol·L^-1 MgCl2）,模板DNA40ng,dNTP0．2mmol·L^-1,引物0．5μmol·L^-1,Mg^2＋,5nmol·L^-1。PCR扩增程序：94℃变性5min,然后进行38个循环：94℃变性30S,48～53℃（根据引物而定）退火30s,72℃延伸1min;最后72℃延伸10min,4℃终止反应。上述反应条件可广泛应用于银杏的遗传多样性分析、遗传育种和转基因等方面的研究。图6表1参19     

无患子SRAP-PCR反应体系的优化

建立适合无患子Sapindus mukurossi的相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应(SRAP-PCR)最佳反应体系,为研究无患子种质资源的遗传多样性、亲缘关系及遗传改良等奠定基础。以南平产的无患子叶片为材料,采用单因素法对体系中的DNA模板、镁离子、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs),引物和TaqDNA聚合酶等5因素进行优化。确立了适合无患子SRAP的最佳反应体系(20μL):1×PCR缓冲液,50 ng模板DNA,2.0 mmol·L-1镁离子,0.2 mmol·L-1dNTPs,0.5×16.67 nkat(0.5 U)TaqDNA聚合酶,0.4μmol·L-1引物。利用该体系对12份无患子种源材料进行PCR扩增,获得了清晰、稳定的DNA谱带,说明优化后的体系适宜无患子地理种源的遗传多样性分析。     

松毛虫mtDNA PCR反应体系优化

为了应用线粒体DNA研究松毛虫种群的遗传结构,本研究采用正交试验设计法L16(45)对影响松毛虫mtDNA PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化试验并对PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了单因素梯度比较优化。建立了松毛虫mtDNA PCR反应的最佳体系即在50μL体系中含模板150 ng、0.10μmol/L引物、0.4 mmol/L dNTP、1.0UTaq DNA聚合酶、2.5 mmol/LMg2+。同时通过PCR比较,确定最佳循环次数为35个循环,最佳退火温度为56℃,获得了松毛虫mtDNA PCR反应的最佳扩增程序。     

光皮桦RAPD分析体系优化设计方案比较

采用单因素设计和均匀设计对光皮桦的RAPD反应体系进行了优化,并对2种设计方案优化出的最佳反应体系的可靠性和稳定性进行比较.结果表明:2种设计均可用于光皮桦RAPD体系的优化,但单因素设计受多因素间交互作用的影响使反应体系达不到最优;而均匀设计能避免盲目性,并快速得到条带清晰、稳定性好的适合光皮桦的最优RAPD体系.     

山核桃RAPD反应体系的优化

建立山核桃RAPD反应优化体系是进行山核桃遗传多样性分析的前提。通过对影响PCR扩增结果的主要因子的组合研究,确定了山核桃Caryacathayensis的最适反应体系和扩增程序,即在20μL反应体系中,含2 5mg·L-1(50ng)模板,2 0μL10×Buffer,16 67pmol·s-1TaqDNA聚合酶;各0 2mmol·L-1dNTPs,3 0mmol·L-1MgCl2,0 3μmol·L-1引物。扩增程序为:94℃预变性300s,94℃变性30s,38℃退火30s,72℃链延伸90s,38次循环,72℃后延伸420s。图5表2参6     

马铃薯致病疫霉EST-SSR PCR反应体系的优化

由致病疫霉(Phytophthora infestans Montagne de Bary)引起的马铃薯晚疫病是危害马铃薯生产的最严重病害。试验以致病疫霉菌株HH06-23为模板,以Pi08N为引物,研究致病疫霉EST-SSRPCR反应体系中各主要成分和退火温度对扩增结果的影响。优化后的PCR反应体系为:25ng模板DNA,0.5mmol·L-1dNTPs,2μL10×Buffer(Mg2+Free),1.75mmol·L-1MgCl2,15pmol引物,1.2UTaqDNA聚合酶,加ddH2O至20μL;同时确定引物退火温度为63℃。PCR体系稳定性试验结果表明,优化后的致病疫霉EST-SSRPCR反应体系稳定、可靠,适合进行致病疫霉群体遗传多样性研究。     

抚育间伐对光皮桦次生林生长的影响

对分布于贵州省织金县茶店乡的7年生光皮桦次生林进行抚育间伐试验。结果表明：抚育间伐对林分胸径、树高和单株材积生长具有不同程度的影响：强度间伐的影响均达到显著程度,中度间伐的影响对胸径、树高生长未达到显著水平,对单株材积生长达到显著程度。试验林分的蓄积量总体上呈逐渐上升趋势,强度间伐林分的蓄积量最高,中度间伐林分次之,对照林分最低。间伐之后10年,强度间伐林分的平均胸径、树高、单株材积和蓄积量,比对照林分分别高31.3%、28.2%、116.5%和44.7%,中度间伐林分比对照林分分别高10.0%、9.3%、30.8%和23.3%。在试验地区中等立地条件下,对林龄为7年、密度达7 630株/hm2以上的光皮桦次生林,进行适宜强度的抚育间伐是十分必要的。如要将其培育成为建筑、家具、坑木等用材林,按株数计算的间伐强度以不低于50%为宜。     

光皮桦光合特性的研究

为揭示光皮桦光合特征,以浙江省的临安无性系、丽水无性系和广西壮族自治区的龙胜无性系3个光皮桦无性系幼株为试验材料,利用LI-6400P便携式全自动光合测定仪,于2010年10月测定了3种试验材料的光合日进程、光合-光响应过程、光合-CO2响应过程.结果表明,光皮桦净光合速率日变化呈单峰和双峰2种类型,临安无性系存在光合“午休现象“,临安无性系、丽水无性系的净光合速率均与龙胜无性系存在显著的差异(P＜0.05),而临安无性系与丽水无性系之间差异不显著(P＞0.05);丽水无性系的气孔导度显著高于临安无性系与龙胜无性系(P＜0.05),而临安无性系和龙胜无性系之间的气孔导度值差异不显著(P＞O.05);3个无性系的光饱和点变化范围在1 342.8～1 609.0μmol/(m2·s),光补偿点在18.1～27.2 μmol/(m2·s),表观量子效率在0.035～0.047;CO2饱和点变化范围在2 000.7～2 350.7μmol CO2/mol,CO2补偿点在61.5～76.7 μmol CO2/mol,羧化效率在0.027～0.040.逐步回归分析表明,临安无性系和丽水无性系净光合速率的主要影响因子是光合有效辐射,龙胜无性系则主要受蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度的影响.     

光皮桦不同家系种子生活力研究

光皮桦是速生、耐瘠薄、适应性强、材质上等的优良用材树种,但在生产中存在采种难、种子小、种子寿命短等问题。本试验以光皮桦22个家系的种子为材料,在低温贮藏的条件下,每月进行1次种子发芽能力检测,探讨各家系种子发芽能力的变化趋势。结果表明,储藏12个月后,14号家系种子发芽率由86.67%下降到20.00%,下降了76.92%;11号家系种子发芽率由58.00%下降到8.00%,下降了86.21%;而50号家系种子发芽率降为0。整个试验中平均发芽率较高且下降较为平缓的3个家系为26号、17号、51号,其平均发芽率分别为75.00%、61.83%、61.67%。方差分析结果表明,光皮桦不同家系之间的种子发芽率差异极显著。     

PEG胁迫对光皮桦种子萌发和幼苗生长的影响

为了研究光皮桦种子在干旱条件下的萌发及生长状况,采用不同浓度的PEG-6000（聚乙二醇）模拟干旱,研究不同干旱胁迫强度对光皮桦种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明：种子的发芽率、发芽势、发芽指数、抗旱指数均在5％浓度处理时最高;在5％浓度处理下幼苗的上胚轴最长,下胚轴长度在没有PEG胁迫下最长。这说明了较低浓度的PEG对光皮桦种子的萌发有明显的促进作用,同时能够对其幼苗上胚轴的生长有促进作用。     

毕节试验区亮叶桦群落特征研究

采用植物群落学方法对毕节试验区亮叶桦(Betula luminifera)群落进行研究。结果表明:群落植物种类丰富,区系成分复杂。群落外貌以中小型叶面积单叶、落叶草质、革质、非全缘的高位芽植物组成为特征。垂直结构成层现象明显,可分为乔木层、灌木层、草本层,并有一定层间植物伴生。     

光皮桦天然群体遗传多样性研究

该文对福建省光皮桦11个天然群体的RAPD和ISSR的遗传多样性和基因多样性进行分析,选择34个引物(25个RAPD引物,9个ISSR引物),对11个光皮桦群体77个个体进行扩增.RAPD引物共检测到270个位点,多态位点267个,占98.52%.ISSR引物共检测到113个位点,均为多态位点.研究结果表明,11个天然群体中沙县罗卜岩自然保护区和武平梁野山自然保护区群体的遗传多样性和基因多样性最丰富,三元群体的遗传多样性和基因多样性最低;群体内的遗传多样性和基因多样性明显高于群体间的遗传多样性和基因多样性;邵武卫闽和沙县罗卜岩自然保护区群体遗传相似度最低.两种标记的UPGMA聚类分析结果虽存在差异,但都将11个天然群体明显分为两大类.该研究结果为光皮桦树种今后的遗传改良奠定了基础.