犬γ干扰素多克隆抗体的制备及生物活性检测

将犬γ干扰素基因和表达载体pET30a双酶切后构建了重组质粒pET30a-CaIFN-γ,并转化到E.coliRosetta感受态中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示,重组蛋白约23 ku并主要以包涵体形式存在。包涵体通过切胶纯化后肌注家兔,制备出CaIFN-γ的抗血清,测得血清效价为1:12 800。对复性后的包涵体通过细胞试验进行抗病毒活性检测,表明重组犬γ干扰素在终浓度为0.09 mg·mL-1时具有一定的抗病毒活性。本试验成功的原核表达、纯化了犬γ干扰素蛋白,制备CaIFN-γ的抗血清,为CaIFN-γ蛋白生物学特深入研究和生产应用奠定基础。     

QIAexpress系统高效表达鸡γ-干扰素cDNA的研究

深入进行基因工程鸡干扰素的研究 ,将前期工作所得到的 p GEM T Easy/ Ch IFN-γ2重组质粒中的 Ch IFN- γ2基因亚克隆到表达质粒 p QE30上 ,构建了重组表达质粒 p QE- Ch IFN- γ2 ,转化大肠杆菌 M1 5,构建了高效表达重组蛋白的双质粒 QIAexpress系统。经对重组蛋白的可溶性判定、包涵体的溶解、纯化、复性及活性测定 ,结果表明 Ch IFN-γ2的表达水平为 2 2 % ,包涵体的纯度为 80 % ,生物学活性为 3 2 0 0～ 6 40 0 U.mg-1 。本方法可供大量制备活性鸡γ-干扰素参考     

重组蛋白sHLA-G1的原核表达与纯化

为了进一步在蛋白质水平对人白细胞抗原HLA-G进行分析,利用已经构建好的克隆质粒pGEM-T-HLA-G1,进一步构建了重组原核表达质粒pET28a-sHLA-G1。SDS-PAGE检测表明,重组蛋白sHLA-G1在大肠杆菌(E.coli)中得到稳定表达,原核表达的重组蛋白sHLA-G1主要以包涵体形式存在。包涵体蛋白经充分洗涤、尿素溶解后用钴离子树脂纯化,并用SDS-PAGE和Western印迹进行了分析,鉴定结果表明,该蛋白纯度达到90%以上,并能与HLA-G特异性抗体87G反应。该研究结果为进一步的复性工作奠定了基础。     

脲对Flt3配体包涵体蛋白质体外复性与同时纯化的作用研究

目的研究小分子脲对包涵体蛋白质体外复性与同时纯化的作用。方法考察在高效疏水相互作用色谱(HPHIC)流动相中添加脲时,不同浓度的小分子脲对包涵体蛋白重组人酪氨酸激酶配体(recombined human Flt3ligand,rhFL)复性效率的影响,并采用荧光光谱技术,进一步研究目标蛋白Flt3复性前后复性效果变化与荧光强度变化的规律。结果当脲的添加浓度为3mol·L~(-1)时,rhFL的质量回收率达到33.1%,更易于恢复其天然构象及生物活性。结论添加适当浓度的脲可促进rhFL的复性与同时纯化,通过荧光光谱技术可以初步推测包涵体蛋白在复性过程中生物活性的变化,为rhFL蛋白药物的研发提供参考。     

猪γ干扰素的基因克隆、改造、表达及活性测定

提取经ConA诱导培养的猪外周血白细胞总RNA ,RT -PCR扩增出猪IFN -γ基因并克隆到pGEM -T -easy载体 ,测序结果表明扩增片段是含有信号肽的猪IFN -γ的完整基因。设计 1对引物亚克隆猪IFN -γ成熟蛋白基因并对其5′端前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。经测序鉴定后插入原核表达载体pRLC ,并实现在大肠杆菌中的高效表达。表达产物以包涵体形式存在 ,经 7mol·L-1盐酸胍的变性液溶解及 0 5mol·L-1盐酸胍复性液复性处理 ,表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化。细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪IFN -γ具有较高的干扰素活性 ,约为 4 5× 10 6U·mg-1。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株M基因的原核表达与重组蛋白的复性研究

采用PCR方法从重组质柱pTG19-T-M扩增得到缺失N端疏水区序列的基因片段tM.将tM与原核表达载体pET-32a进行连接并转化,重组质粒经鉴定并测序.结果表明,目的基因在大肠杆菌BL21细胞中成功地表达了醉繁殖与呼吸病毒重组蛋白pET-tM.表达量为31%.表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为29 kD的重组蛋白且以包涵体形式存在.8 mol·L~(-1)尿素变性溶解包涵体,再用稀释与透析相结合的方法对重组蛋白进行复性.复性蛋白经Western-blot检测,结果证明复性蛋白可被PRRSV阳性血清识别用.     

非洲猪瘟病毒衣壳五邻体顶点蛋白(H240R)原核表达及免疫原性研究

【目的】原核表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)次要衣壳五邻体顶点蛋白(H240R),并研究其免疫原性。【方法】运用生物信息学软件初步预测分析H240R蛋白的理化性质、二级和三级结构。目的基因序列密码子优化后全基因合成,利用基因重组技术构建重组载体pET28a/H,通过原核系统表达目的蛋白,筛选最优的诱导温度和诱导时间。目的蛋白(包涵体)通过含2M尿素洗涤缓冲液洗涤和亲和层析进行纯化。利用梯度透析对纯化的目的蛋白进行复性,Western和Dot-ELISA鉴定复性的目的蛋白。复性蛋白和佐剂ISA201乳化后免疫小鼠,评价H240R蛋白免疫原性及其在小鼠体内诱导的抗体消长规律。【结果】生物信息学分析显示H240R蛋白分子量约为27 kDa,等电点为9.40,无跨膜结构域,抗原指数较高。成功构建大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/pET28a/H,在不同温度诱导条件下H240R蛋白均以包涵体形式表达。包涵体蛋白经过洗涤和亲和层析纯化后,纯度达85%以上。大约65%纯化蛋白可通过梯度透析进行复性。Western显示His抗体可以和融合蛋白结合显色,表明目的蛋白表达正确,Dot-ELISA显示阳性血清和复性的目的蛋白反应,表明复性的H240R蛋白具有正确的构象。复性蛋白免疫小鼠后,可刺激小鼠产生抗体,二免后10 d达到平台期,可以稳定持续30 d左右。【结论】ASFV衣壳五邻体顶点蛋白H240R在原核系统中以包涵体形式表达,纯化复性的目的蛋白具有良好的免疫原性,并且可以和阳性血清反应。这些可为进一步研究H240R蛋白的结构和功能,以及ASFV亚单位疫苗研制提供参考和思路。     

耐热木聚糖酶xynB_(64)和红色荧光蛋白Dsred2的融合表达及其应用

[目的]耐热木聚糖酶xynB64的表达研究,探讨利用红色荧光蛋白Dsred2标签简便快捷地检测包涵体复性的效率。[方法]构建重组质粒pET42a-xynB64和pET42a-xynB64-Dsred2,利用宿主菌Rosetta(DE3)进行表达,DNS法测定酶活,并检测其荧光强度和尿素复性的包涵体。[结果]红色荧光蛋白Dsred2促进了目的蛋白可溶性表达,重溶包涵体经激发后发射光波长在583 nm,光强度与可溶性大致成正比。[结论]研究表明红色荧光蛋白Dsred2在包涵体复性中可作为报告蛋白,该结果为工业化复性包涵体提供了检测依据。     

重组鲤鱼生长激素的试验制备与纯化

采用高效表达鲤鱼生长激素的大肠杆菌基因工程菌株E .coli(pBVcGH8)进行发酵培养 ,经温度诱导可产生一分子量约为 3.6 3× 10 -2 0 g的特异表达产物 ,该表达产物主要以包涵体的形式存在 ,表达量占菌体总蛋白的 2 9.2 %。表达产物经包涵体收集、洗涤等初步纯化后 ,纯度可达 85 .0 %。再经变性与复性后 ,用阴离子交换层析进一步分离纯化 ,最终可获得纯度为 96 .0 %的重组鲤鱼生长激素。用该纯化过的重组鲤鱼生长激素注射罗非鱼 ,有明显的促生长作用     

重组谷氨酰胺转胺酶的表达、复性及纯化 

以吸水链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到谷氨酰胺转胺酶基因片段,构建pGEX-TGase重组质粒,并转化到大肠杆菌中得到重组菌BL21/pGEX-TGase。重组菌经乳糖诱导产生融合蛋白,并对诱导条件进行了优化。表达产物主要以包涵体形式存在,采取稀释及尿素梯度液相色谱结合的方法,成功地实现了包涵体蛋白的复性。通过GST亲和柱纯化目的蛋白,得到酶活为29U/mg的电泳纯目的蛋白。     

包涵体蛋白的复性研究进展

介绍了包涵体的洗涤、变性溶解和传统的复性方法,详细阐述了包涵体蛋白的层析复性方法以及复性过程中的添加剂效果。     

抗伊维菌素scFv蛋白质的变复性及纯化

基因工程技术的发展扩大了蛋白质研究领域,简化了研究步骤。原核表达系统表达目的蛋白质具有操作简单、培养周期短、高效经济、便于纯化等优点,但大部分表达的蛋白质是以包涵体的形式存在。包涵体是蛋白质在细胞内凝集形成的无活性不溶于水的固体颗粒,含有重组蛋白质及核糖体元件、内毒素、外膜蛋白质、RNA聚合酶和脂体等。在高浓度的变性剂如尿素、盐酸胍等中由于氢键、疏水键被破坏,包涵体蛋白质完全伸展而溶解,在复性剂中可重新折叠形成天然结构而重新获得活性[1]。     

体外蛋白质复性方法及小分子添加剂在复性过程中的作用

变性蛋白质体外复性的方法主要有传统的辅助复性法包括了:稀释法、透析法、超滤法以及蛋白质折叠液相色谱法(PFLC),也有在此基础上模拟体内分子伴侣、折叠酶、人工分子伴侣、反胶束的辅助复性方法。到目前为止,在复性液中添加小分子试剂是提高体外辅助蛋白质复性效率的策略之一。其目的是为了降低蛋白质复性过程中聚集形式的形成,从而促进变性蛋白质向其天然和活性构象的转变。这种方法在一定程度上能够提高蛋白质的复性效率并且得到了长足的发展。为了捕捉变性蛋白质向其活性结构折叠过程的差异性变化规律,明确小分子添加剂对体外辅助蛋白质分子折叠过程的机制,推测一些小分子添加剂辅助蛋白质色谱复性过程中构象的变化规律,为解决包涵体蛋白质难于复性和复性效率低的问题起到指导性的作用。     

人基质蛋白酶2(MMP-2)血红素结合蛋白样结构域原核表达、复性及生物学活性验证

用RT-PCR从人神经胶质瘤U87细胞扩增人基质金属蛋白酶-2(MMP-2)血红素结合蛋白样结构域(PEX)基因,克隆到pMD18-T载体然后测序;将PEX定向克隆到PET-25b(+)中构建原核表达载体PET-PEX,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达产生表达量近40%的包涵体蛋白,表达蛋白分子量大小约28.0 KD,与预期大小相符.包涵体经优化洗涤,8 mol/L尿素变性,采用透析法进行复性.鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验显示复性后的PEX蛋白能显著抑制鸡胚新生血管生成(P<0.05),并且其抑制作用表现出一定的剂量依赖性.     

苦荞过敏原TBa和TBb基因的共表达及其包涵体复性的研究

[研究目的]利用大肠杆菌共表达苦荞过敏蛋白的两个亚基,并对表达产物进行包涵体复性研究和免疫学活性分析;[方法]用已构建的表达质pET-28a-TBa和pET-32m-TBb,共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,利用双抗生素筛选法,获得稳定遗传的双质粒转化子,经IPTG诱导,两个基因在同一宿主菌中共表达,在共表达产物复性过程中,两个亚基互为分子伴侣,相互促进了蛋白质的重新正确折叠;[结果]表迭蛋白以包涵体的形式存在,ELISA检测表明:复性后的蛋白免疫学活性得到了提高;[结论]由此获得了有活性的蛋白质,并且建立了不相容双质粒共表达外源基因和包涵体复性的方法.     

人β2微球蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

β2微球蛋白(β2m)是主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ类分子的轻链部分,该蛋白的原核表达与纯化是制备MHC-Ⅰ类分子的首要条件。利用已经构建好的β2m原核表达载体pET 23a+β2m,在大肠杆菌(E.coli)中获得稳定表达。原核表达的β2m大部分在包涵体中,包涵体蛋白经充分洗涤、变性(尿素溶解)和复性,并以强阴离子交换柱层析(Q-Sepharose)纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β2m,W estern印迹法分析表明,该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性。     

重组鸭α-干扰素的抗病毒活性

本研究参考大肠杆菌密码子的偏好性,对GenBank中已经发表的鸭α-干扰素基因序列进行优化,人工合成后与原核表达载体pET30a-ELP连接,构建原核表达质粒pET30a-DuIFNα-ELP。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,IPTG诱导表达重组蛋白DuIFNα-ELP。根据类弹性蛋白多肽(ELP)具有温度敏感的可逆相变特性,通过重复可逆相变循环(ITC)纯化重组蛋白质;纯化的蛋白质主要以包涵体的形式存在,通过变性、复性处理后,采用细胞病变抑制法分别在MDCK/VSV和DEF/VSV中检测重组蛋白质的抗病毒活性。结果表明,合成的重组鸭α-干扰素基因能成功表达,重组蛋白DuIFNα-ELP分子质量约80 000,纯化后的重组蛋白质纯度约90%。通过抗病毒试验检测重组DuIFNα-ELP在MDCK/VSV系统中的抗病毒活性为1.0×10~6 U/ml,比活性为1.25×10~6 U/mg;在DEF/VSV系统中的抗病毒活性为1.0×10~7 U/ml,比活性为1.25×10~7 U/mg,比MDCK/VSV系统中活性高10个单位,验证了干扰素的抗病毒活性与受体细胞的应答可能存在一定关系。这一研究结果为鸭α-干扰素防治禽类病毒性疾病的探索奠定了基础。     

尿素浓度梯度复性重组牛白细胞介素-2

尿素浓度梯度已成功用于多种重组蛋白的复性,对尿素浓度梯度复性rbIL-2进行研究,结果表明:调整变性rbIL-2的浓度在4 mg/mL左右,添加DTT使其达到10 mmol/L,4℃搅拌过夜,4℃分别对4、3、2、1 mol/L尿素,50 mmol/L Tris.Cl,pH 8.5透析12 h,然后再对pH 8.5的PBS透析12 h,可成功对rbIL-2复性,复性率达70%左右。生物活性测定表明得到了具有较高生物活性的rbIL-2。     

猪干扰素-γ基因的表达、纯化及活性分析

依照猪IFN-γ基因序列设计引物,将该基因克隆至原核表达载体pET-30a,构建pET-30a-pIFN-γ重组表达载体,转化入寄主菌BL21(DE3),经PCR、双酶切、测序鉴定正确后,用IPTG进行诱导表达,可溶性的表达产物分别经镍柱和Sephadex-G100纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化,然后进行SDS-PAGE、Western-blot分析,并用细胞病变抑制法进行重组猪IFN-γ活性测定.结果表明:试验得到了高纯度的重组pIFN-γ,且纯化的重组猪IFN-γ蛋白具有较高的干扰病毒复制的活性,对PRV的活性为2.0×103U.mg-1,而对标准O型口蹄疫病毒的活性为2.56×105U.mg-1.     

包含体表达基因工程牛生长激素提取、变复性及纯化的研究

为了取得较好的复性效果.对重组牛生长激素的纯化及变复性条件进行了研究.结果表明;发酵菌体高压匀浆破碎、离心得到的包含体在7.5 mol/L尿素中变性24 h后.以100 mmol/L Tris·HCI pH 10.0稀释至尿素浓度4.5 mol/L,4℃复性48 h,对20 mmol/L Tris·HCI pH 9.0透析除盐可以成功对重组牛生长激素复性;采用截留分子量100 kD、5 kD超滤膜对复性重组牛生长激素浓缩,FPLC纯化后可得到高纯度的目标蛋白.