捻转血矛线虫纯净3期幼虫制备方法的改进

从自然感染羊体内获得捻转血矛线虫雌虫后,收集其子宫中的虫卵进行培养,再将纯净的第3期幼虫感染保种山羊,于虫卵排出高峰期大量收集粪便,进行幼虫培养,可获得大量纯净的捻转血矛线虫第3期幼虫。     

捻转血矛线虫脂肪酶基因表达与生物学特性分析

选取捻转血矛线虫脂肪酶(Lipase)进行基因克隆、表达并对其生物学特性进行探究。PCR克隆捻转血矛线虫lipase基因,构建表达载体,获得融合蛋白质,采用Western blot检测该蛋白质的抗原特性;酯类酶解反应检测该融合蛋白质脂肪酶活性;实时定量PCR检测该基因在捻转血矛线虫不同发育阶段的转录情况;间接免疫荧光试验检验该抗原蛋白质在虫体组织的定位情况。结果表明,去除lipase基因信号肽序列后,基因片段长864bp,融合蛋白质大小50ku;该融合蛋白质在37℃左右、pH为7的条件下酶活力最高;雄性成虫lipase转录量相对虫体其他阶段最高;该抗原蛋白质主要表达于虫体表皮和肠腔。Lipase具有较好的抗原性,可能与捻转血矛线虫发育和宿主免疫调节有关,深入研究捻转血矛线虫Lipase的特性对寻找新的免疫保护性抗原和药物靶标具有意义。     

捻转血矛线虫HSP60原核表达及特性分析

根据Gen Bank公布的捻转血矛线虫热休克蛋白60(HSP60)基因序列,设计一对特异性引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,通过RTPCR技术扩增出一条约为1 700 bp的DNA片段,将该片段克隆到p MD19-T载体上进行序列分析,结果显示该片段长1 710 bp,编码569个氨基酸。将该基因片段亚克隆到p ET32a(+)载体上,转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE显示,该基因成功表达,其融合蛋白分子量为80.7 ku,主要分布于菌体上清中。Western blot结果显示该重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊血清所识别。Real-time PCR分析显示,HSP60基因在第三期幼虫和活化第三期幼虫中的相对表达量分别为1.0和0.88。本文探讨捻转血矛线虫HSP60功能奠定了基础。     

捻转血矛线虫Hc38基因部分功能域的原核表达与鉴定

为原核表达捻转血矛线虫Hc38基因的保守结构域,本研究参照GenBank中Hc38基因序列设计引物,扩增出Hc38基因的保守结构域序列,命名为HcP,将其克隆到表达载体pET32a中,并转化到大肠杆菌BL21中,用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE和western blot结果表明,HcP基因在大肠杆菌中高效表达,表达的重组蛋白分子量约为49.4 ku,并且表达产物能够与感染捻转血矛线虫的山羊血清产生特异的免疫印记条带,具有良好的反应原性.     

捻转血矛线虫ES24抗原基因的原核表达及其免疫诊断的应用

将ES24基因从pUC18-ES24重组质粒中亚克隆到pET-30a原核表达载体上,构建重组表达质粒pET-30a-ES24,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western-blot分析表明,表达蛋白相对分子质量约为30 000,可被6×His抗体和捻转血矛线虫阳性血清所识别。纯化后的重组表达蛋白作为诊断抗原具有良好的免疫反应性和特异性,可用作免疫诊断试剂。     

林麝捻转血矛线虫的分子鉴定

为鉴定林麝粪样中疑似血矛属线虫虫卵的虫种,本研究提取四川和陕西地区林麝粪样中疑似血矛属线虫的虫卵DNA,对其核糖体内转录间隔区(ITS)全序列进行PCR扩增与序列分析。结果显示14个疑似血矛属线虫的虫卵DNA样品ITS全序列片段大小为786 bp~788 bp,序列相似性为99.0%~100%;经序列BLAST比对和系统发育分析,所有疑似血矛属线虫的虫卵样品均为捻转血矛线虫,与NCBI基因库中多株捻转血矛线虫的ITS序列相似性为97.0%~99.5%。研究结果表明,寄生于林麝的血矛属线虫为捻转血矛线虫,从而为控制林麝捻转血矛线虫病提供了重要依据。     

捻转血矛线虫HLJ株15 ES抗原基因的原核表达

为了对羊源捻转血矛线虫(H.contortus)15 ES抗原基因进行原核表达,本研究利用RT-PCR技术从黑龙江省羊源H.contortus成虫总RNA中扩增得到相对分子质量15Ku ES蛋白基因(H15 ES),序列分析表明,其核苷酸序列与国外已发表的15 ku排泄分泌抗原基因的同源性为99.78%.将H15 ES克隆至pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a-H15 ES,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳和western blot分析表明,表达蛋白相对分子质量约为35.2 ku.本研究为H.contortus病诊断抗原和保护性抗原的大量制备及H.contortus核酸疫苗的研究奠定了基础.     

捻转血矛线虫重组磷脂酰肌醇转移蛋白对山羊外周血单个核细胞模式识别受体和细胞因子转录水平的影响

本文旨在研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)磷脂酰肌醇转移蛋白(phosphatidylinositol transfer protein, HCPITP)对山羊的免疫调节功能。构建了原核表达重组质粒pET-28a-HCPITP并获得重组蛋白;分析HCPITP基因在虫卵、第三期幼虫、雌虫和雄虫中转录水平的变化;将重组蛋白与山羊外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)共孵育,研究重组蛋白对山羊PBMCs增殖、模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)表达和细胞因子分泌的影响。结果显示,HCPITP基因在雌虫、雄虫、第三期幼虫和虫卵中相对转录水平分别为1、10.2、0.47和0.58。Western blot分析发现该重组蛋白具有较好的反应原性。该重组蛋白能够显著抑制ConA对PBMCs的增殖作用,重组HCPITP显著促进山羊PBMCs的IL-2、IL-4、IL-6和IL-17转录水平,主要促进模式识别受体TLR1与TLR10的转录。综上,HCPITP基因转录水...     

羊消化道4种易混淆线虫虫卵的形态学观察与比较

为了方便临床上鉴定羊消化道常见且易混淆线虫虫卵并丰富相关资料,试验从羊消化道中采集疑似捻转血矛线虫、夏伯特线虫、食道口线虫和奥斯特线虫共4种线虫,采用形态学和分子生物学方法鉴定虫种,将4种线虫于体外短暂培养后得到纯种虫卵,通过观察虫卵不同发育阶段的胚胎形态变化获取每种线虫虫卵形态特征,并对虫卵的长径、宽径和长宽比进行测定。结果表明：经鉴定4种线虫分别为捻转血矛线虫、绵羊夏伯特线虫、粗纹食道口线虫和普通奥斯特线虫。4种线虫虫卵初期胚胎多呈收缩状态且形似桑葚,在外观形态上具有相似性,均为双层卵壳,多数对称,少数不对称。捻转血矛线虫虫卵呈短椭圆形,颜色较浅;绵羊夏伯特线虫虫卵呈椭圆形,颜色较捻转血矛线虫虫卵深;粗纹食道口线虫虫卵呈长椭圆形,颜色较捻转血矛线虫虫卵深,与绵羊夏伯特线虫虫卵相近;普通奥斯特线虫虫卵亦呈长椭圆形,颜色与捻转血矛线虫相近,较绵羊夏伯特线虫和粗纹食道口线虫虫卵浅。虫卵在生理盐水中培养1～6 d后,捻转血矛线虫、绵羊夏伯特线虫和普通奥斯特线虫依次进入蝌蚪期和幼虫期,但仅凭肉眼依然难以区分虫卵种类;绵羊食道口线虫未观察到含蝌蚪或含幼虫的虫卵,仅在桑葚期观察到胚胎收缩成1团及...     

捻转血矛线虫重组H11抗原山羊免疫保护性试验

以重组H11-1、H11-2及H11-1与H11-2混合物分别免疫山羊后,ELISA检测发现血清抗体均在首次免疫后14 d达到较高水平,在第2次免疫后10 d达到高峰。用10 000只捻转血矛线虫第3期幼虫攻击山羊后,对不同免疫组山羊排出虫卵数、虫卵孵化率和成虫数的统计分析结果表明,免疫组与对照组间差异不显著,但免疫组雌虫数显著少于对照组,这对防治捻转血矛线虫病可能会起一定的作用。     

Cloning and Prokaryotic Expression of L1 Gene of Bovine Papillomavirus Genotype 13

This experiment was conducted to clone and express L1 gene of bovine papillomavirus genotype 13 (BPV13).Specific primers were designed according to the published sequences of BPV13, and 1 494 bp L1 gene fragment was amplified by PCR.After digestion by BamHⅠand Hind Ⅲ, the fragment was inserted into the prokaryotic expression vector pET28a(+) to construct the recombinant plasmid pET28a-L1.The recombinant plasmid pET28a-L1 was identified by double enzyme digestion and nucleotide sequencing, and was transformed into E.coli BL21(DE3).The expression of pET28a-L1 was induced by IPTG after selecting the best concentration and time.The results showed that L1 gene was exactly inserted into the prokaryotic expression vector pET28a(+), after induction, the target protein containing His-tag was successfully expressed by expression bacteria which included recombinant plasmid pET28a-L1;SDS-PAGE result showed that the molecular mass of the protein was 60 ku which was consistent with the expected size;After ultrasonic treatment, SDS-PAGE result showed that the protein existed in the precipitation;The target protein was a fusion protein with His-tag verified by Western blotting.This study laid a solid foundation for the research of function of BPV13 L1 gene and the development of effective DNA vaccine of BPV13.     

牛乳头状瘤病毒13型L1基因的克隆及原核表达

本研究旨在克隆并表达牛乳头状瘤病毒13型(BPV13)L1基因。以BPV13基因组为模板,通过PCR技术扩增得到大小1 494 bp的目的片段,同时用BamHⅠ和Hind Ⅲ分别对目的片段和pET28a(+)载体进行双酶切,将双酶切后的L1基因片段克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-L1重组质粒,双酶切和测序鉴定正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中,筛选出最佳IPTG浓度和最佳诱导时间后进行诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,L1基因正确插入到原核表达载体pET28a(+)中;IPTG诱导后含重组质粒pET28a-L1的表达菌成功表达了带His标签的融合蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白分子质量为60 ku,与预期大小一致,超声破菌后,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白存在于沉淀中;Western blotting验证为带His标签的融合蛋白。本试验为进一步研究BPV13 L1基因的功能及为BPV13有效DNA疫苗的研制奠定基础。     

猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达

利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0kb的基因片段，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列。将所得的核心苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较，同源性均在99%以上，从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性。将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2；将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f。利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况，结果发现pET17bVP2f质粒在45kD处有一特异性表达带，而其它几种质粒均未看到特异性表达带，推测VP2基因3‘端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响。这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义。     

禽呼肠孤病毒σC基因的克隆和表达

采用RT-PCR技术设计扩增禽呼肠孤病毒(ARV)S1133毒株的σC基因,将扩增基因克隆至pMD-19T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆的基因片段为ARV σC基因.将该基因重组至pET32a(+)原核表达载体上成功构建了表达裁体pET32a-σC.该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1.0 mmol/L IPTG诱导5 h得到最佳表达.表达重组蛋白的相对分子质量为54 000,以包涵体形式存在.经Western-blot分析表明,该重组蛋白能于ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性.     

减蛋综合征病毒纤维蛋白主要抗原结构域原核表达及抗原性鉴定

利用生物信息学软件对减蛋综合征病毒(EDSV)AV-127纤维蛋白进行抗原特性分析,人工合成融合基因Knobs,将其克隆到原核表达载体pET28a的多克隆位点,构建原核表达载体pET28a-Knobs,将其转化到感受态细胞Rosetta(DE3)pLysS中,经30℃、1.0 mmol.L-1IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀。结果显示:目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为26.0 ku;Western blot结果表明目的蛋白具有较好的抗原活性。本试验为进一步研究EDSV抗原结构域的免疫原性以及减蛋综合征基因工程疫苗的开发奠定了基础。     

抗菌肽V13KL原核表达载体的构建及其表达产物的鉴定

将V13KL编码基因片段克隆到原核表达载体pET30b（＋），并在目的蛋白N端设计肠激酶酶切位点，构建出pET30b（＋）-VK13L重组质粒，转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），优化诱导条件，使得抗菌肽得到了高效表达。经Tricine-SDS-PAGE和Westernblotting鉴定，目的蛋白的相对分子质量与预期一致。结果表明，V13KL基因成功克隆并且获得表达，在诱导体系中加入1mmol／LIPTG诱导6h便可检测到蛋白表达。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

从辽宁省某鸡场分离到一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)。以该毒株基因组核酸为模板,应用RT-PCR扩增得到VP2基因,构建表达质粒pET28a-VP2,再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析在48ku处出现特异性蛋白条带;经Western blot分析VP2蛋白可以与IBDV阳性血清发生特异性反应。用VP2蛋白制备的油乳剂疫苗免疫接种SPF鸡,2周后体内可以检测到特异性抗体。证明VP2蛋白具有重要的应用价值,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶对S774A.1巨噬细胞的毒性作用

为探究旋毛虫成虫排泄分泌抗原(ES)中丝氨酸蛋白酶对宿主免疫调节作用,用PCR扩增出旋毛虫成虫期特异性丝氨酸蛋白酶基因Zh68,克隆至表达载体pET28a,转化到大肠埃希菌BL21( DE3),经诱导表达后的重组蛋白免疫接种动物获取抗血清.将抗体封闭前后的ES分别作用于S774A.1巨噬细胞,CCK-8检测巨噬细胞的增...     

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)氨基肽酶基因克隆、表达及重组蛋白活性分析

通过RT—PCR扩增出捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）氨基肽酶基因，并对该基因进行克隆、鉴定及序列测定。捻转血矛线虫氨基肽酶ORF由2919个碱基（972个氨基酸）构成，和GenBank中的捻转血矛线虫氨基肤酶（H11抗原）同源性高达98％。与秀丽新杆线虫（Caenorhabditis elegans）肽酶M1家族同源性为61％，且具有氨基肽酶特征性基序HEXXH和GAMEN。将该基因亚克隆到原核表达栽体并进行了表达，通过测定重组蛋白分解氨基肽酶底物的能力以及对酶抑制荆敏感性试验，进一步证实了H11抗原具有一定的酶活性。