猪圆环病毒2型Cap蛋白表达及免疫原性鉴定

以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白家蚕表达体系的构建与鉴定

为了用家蚕杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白,将不同株系的PCV2 Cap蛋白基因、人工改造的Cap蛋白突变体基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体,用共转染技术成功构建了重组杆状病毒.将重组杆状病毒感染家蚕,成功获得了大量Cap蛋白的表达产物.结果表明,纯化蛋白主要为病毒空衣壳粒子,推算PCV2空衣壳在...     

杆状病毒表达系统融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白与口蹄疫病毒VP1蛋白及免疫原性评估

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白,能诱导宿主产生特异性免疫应答。口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,能刺激机体产生中和抗体。利用杆状病毒表面展示系统,将这2种病毒蛋白与猪CD40配体(CD40 ligand,CD40L)进行融合表达并展示在杆状病毒表面,构建了rv Ac-Cap、rv Ac-VP1和rv Ac-Cap-VP1 3种重组杆状病毒。通过SDS-PAGE和Western blotting检测3种重组杆状病毒感染的Sf9细胞总蛋白,证明3种融合蛋白成功表达。纯化的重组杆状病毒颗粒以1×108pfu/只的剂量免疫接种BALB/c小鼠,通过间接ELISA检测血清中Cap和VP1的抗体浓度,证明表面展示有Cap和VP1的重组杆状病毒能激发小鼠产生较高水平的抗体,与PCV2和FMDV商品化疫苗免疫组的抗体浓度差异不显著(P0.05),表明该重组杆状病毒具有较好的免疫原性。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的研制及其应用

以真核表达的猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白所形成的病毒样颗粒作为免疫原,按照常规方法免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA法和间接免疫荧光试验（IFA）筛选,总共获得了4株分泌抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为7A6、3F2、3B7、1A6。4株单抗腹水效价均达到1:10⁵。IFA和免疫过氧化物酶单层实验结果显示,4株单抗均能与PCV2发生特异反应,与PCV1无交叉反应。PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的制备,为猪圆环2型病毒抗原表位分析及其相关抗原抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒的构建及鉴定

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了猪圆环病毒2型Cap蛋白,并对该蛋白的生物活性进行鉴定。PCR获得Cap基因并克隆入pFastBacTMⅠ载体质粒,重组质粒pFastBacⅠ-Cap转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-Cap。以脂质体法将重组杆粒转染对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒。电镜下可见典型的杆状病毒,SDS-PAGE显示,重组病毒表达的Cap蛋白约28ku,间接免疫荧光试验证明,Cap蛋白良好表达并具有免疫反应性,为猪圆环病毒亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

猪圆环4型病毒Cap蛋白的原核表达

以本实验室扩增的内蒙猪圆环4型病毒(PCV4)毒株的ORF2基因序列为参考,对其密码子进行优化并送往公司进行质粒合成,通过设计特异性引物,扩增出Cap蛋白基因.将目的基因克隆至pET-28a载体,构建出pET28a-PCV4-Cap重组表达质粒.将重组质粒转化至表达宿主菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达,制备...     

猪圆环病毒2型Cap蛋白杆状病毒载体表达及免疫保护性分析

为了获得低成本高产量的抗原表达,开发新型、有效防控猪圆环病毒的亚单位疫苗,根据猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白序列,通过软件设计优化了密码子并合成cap基因,利用多角体病毒作为载体,构建了表达PCV2 Cap蛋白的重组病毒,命名为flashBAC-PCV2-ORF2株.经过鉴定,证明该病毒株表达Cap蛋白的抗原量在...     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组耐热新城疫病毒的构建及免疫原性

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,给全球养猪业造成了巨大的经济损失.为研发新型PCV2疫苗,采用反向遗传操作技术,以耐热低毒的新城疫病毒TS09-C株为载体,将PCV2主要免疫原蛋白Cap以单独编码框的方式插入至TS09-C株的基因P和M之间,为增强Cap蛋白在载体内的高效...     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白体外表达研究现状

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原体,会破坏免疫系统,引起多种病毒或细菌的混合感染与继发感染,给养猪业造成了巨大经济损失.目前疫苗免疫仍然是防控PCVAD的有效手段,核衣壳蛋白(Cap)是主要免疫保护性抗原,因此Cap蛋白基因工程疫苗是研究的理想靶抗原,获得大量、可溶性、富有活性...     

猪圆环病毒2型Cap蛋白的可溶性表达、纯化及鉴定

为获得可用于猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)抗体检测的重组抗原Cap蛋白,根据GenBank中发表的PCV2 ORF2序列设计物,以PCV2 JS株基因组为模板,PCR扩增出无核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的ORF2基因片段,插入质粒pET-30a(+)构建重组表达质粒pET-ORF2ΔNLS,IPTG可诱导该重组菌表达约27 ku大小的重组蛋白。进一步分析发现该蛋白在大肠杆菌中主要以可溶性形式存在;镍柱亲和层析法纯化该蛋白,用PCV2阳性血清进行免疫印迹试验,结果发现纯化的重组蛋白能与PCV2抗体发生特异性反应,表明该纯化的蛋白具有很好的免疫反应原性,可用于临床样本中PCV2抗体的检测。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

利用pET32a(+)-Cap重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果表明,抗原最适包被浓度为4μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,37℃封闭3 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min,37℃显色15 min,判定血清样品P/N≥2.1,且OD450≥0.228为阳性。该方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5.65%和5.81%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对123份血清样品进行检测,检测结果阳性率78%,与国产商品化试剂盒检测结果对比,符合率为91.9%,表明本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性,适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。     

猪圆环病毒2型Cap羧基端多肽原核表达及抗原性分析

本研究用PCR方法获得猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白基因,经酶切后将ORF2 3′端部分基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌BL21,加入终浓度为0.3 mmol/LIPTG,在30℃诱导表达6 h后,经SDS-PAGE及western-blot分析,目的基因得到正确表达,大小约为40 ku。收集菌体并进行超声裂解后证实,表达产物以可溶蛋白与包涵体共同存在。对可溶蛋白与包涵体分别进行纯化,分别用做ELISA包被抗原检测PCV2抗体,结果两者无明显差异。     

猪圆环病毒2型ORF1和ORF2基因的克隆与表达

根据GenBank猪圆环病毒2型基因序列,设计合成两对特异性引物,对厦门株-1进行PCR扩增,得到ORF1和ORF2基因。将PCR产物酶切后,插入到pET-22b载体中,构建原核表达载体pET-22b/ORF1、pET-22b/ORF2,转化大肠杆菌BL21(DE_3),经IPTG诱导表达,收集茵液进行SDS-PAGE分析。确定重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni~(2 )离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,逐步透析法进行复性。Western blot和ELISA分析结果表明Rep蛋白和Cap蛋白均能与猪圆环病毒2型阳性血清发生特异性反应。     

联合表达PCV2 ORF2和PPV VP2基因病毒样颗粒获得及免疫原性

将包含有完整阅读框架,长1 740、705 bp的PPV VP2基因、PCV2 ORF2基因分别插入真核表达栽体pPI-2.EGFP,构建了重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2.观察由脂质体介导转染重组质粒后的Vero细胞,结果最早在转染后20 h左右出现荧光,36 h达到高峰;对转染细胞进行电镜检测,结果观察到病毒样颗粒存在.为证实所获病毒样颗粒是否为重组颗粒,将纯化后的病毒样颗粒免疫仔猪,检测其血中T淋巴细胞的动态变化以及血清抗体水平.结果免疫仔猪的CD3+、CD4+T淋巴细胞在外周血淋巴细胞中的比率均有一定程度的升高;CD8+T淋巴细胞在免疫后7～14 d有所下降,之后再升高.抗体检测结果表明,免疫动物血清中有较高水平的PPV、PCV2特异性抗体.结果表明重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2获得成功表达并形成重组病毒样颗粒,且该颗粒具有良好的免疫原性.     

猪圆环病毒2型多表位串联体诱导表达及其免疫活性

为了获得体外诱导表达的具有良好免疫原性的PCV2多表位串联体。本试验筛选PCV2主要抗原表位,顺序组成多表位串联体,人工合成其cDNA序列,通过BamHⅠ和SalⅠ定向克隆至原核表达载体pEGX-4T-1多克隆位点,转化BL21感受态细胞,筛选阳性克隆,进行IPTG诱导表达。使用SDS-PAGE对目的基因表达情况进行分析,提取与纯化融合蛋白多肽,Western blot鉴定表达多表位串联蛋白免疫活性。融合蛋白多肽免疫BALB/c小鼠,ELISA测定其抗体,评价其免疫原性。结果显示,成功构建了含7个PCV2抗原表位串联体的表达重组质粒pEGX-4T-1-ep,SDS-PAGE分析显示,融合蛋白多肽在大肠杆菌中获得了有效表达,其分子量约35ku,主要以可溶性形式存在。Western blot结果显示,提取与纯化融合蛋白多肽与PCV2阳性血清具有良好的反应原性。ELISA检测结果显示,纯化的融合蛋白多肽可有效刺激机体产生PCV2特异性抗体,具有良好的免疫原性。结果表明,构建的PCV2多表位串联体表达重组体具有良好的体外表达特性,表达蛋白具有良好的免疫原性。该研究为PCV2表位筛选,功能鉴定及多表位疫苗研究奠定了一定基础。     

重组新城疫病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的研究

为构建表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap)的重组新城疫病毒(NDV),本研究利用NDV LaSota弱毒疫苗株为活病毒载体,通过反向遗传操作系统构建出表达PCV2 Cap的重组病毒(rLa-PCV2/Cap),以及表达删除核定位信号(NLS)的Cap(Cap△41)的重组病毒(rLa-PCV2/Cap△41),并对外源蛋白的表达效果进行了检测.通过间接免疫荧光试验证明,两种重组病毒感染的BHK-21细胞中,PCV2 Cap蛋白以及删除NLS的Cap△41蛋白均获得正确表达;其中,完整的Cap蛋白定位于核内,而删除NLS的Cap△41蛋白则定位于胞浆中,本研究结果为研究新型PCV2疫苗奠定基础.     

猪圆环病毒2型全基因组序列分析及Cap蛋白CTL表位预测

【目的】监测当前湖南省猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)流行毒株及其衣壳蛋白(capsid protein, Cap)变异情况,并预测Cap蛋白细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)表位,为新型PCV2疫苗研制和病毒净化提供参考依据。【方法】本研究对2019-2021年于湖南省6个地区收集的17份PCV2阳性组织样品进行PCV2全基因组序列扩增及测序分析,绘制系统进化树,利用生物信息学方法分析Cap蛋白氨基酸变异情况,并预测CTL表位。【结果】系统进化树显示,获得的17株PCV2全基因组序列中,1株PCV2a、7株PCV2b和9株PCV2d。Cap蛋白氨基酸序列比对分析发现,共有16个氨基酸残基突变位点位于病毒Cap蛋白表面,且有11个突变位点参与构象型表位的形成。此外,共预测出9个PCV2 Cap蛋白潜在的CTL表位,其中4个表位(16-24、28-36、136-144和179-187位氨基酸)在GenBank的1 610株PCV2不同基因型毒株中高度保守。通过TCR-pMHC复合物3D结构对4个保守性...     

Preparation of Monoclonal Antibodies against Porcine Circovirus Type 2 Cap Protein

The structural protein Cap encoded by ORF2 of porcine circovirus type 2 (PCV2) was expressed in genetic engineering recombinant bacteria and used as the immunogen after purification.Five hybridoma cell lines against PCV2 Cap protein named as 3D12,4D5,4B9,4C9 and 4G10,respectively,were developed after fusion between SP2/0 myeloma cells and spleen cells of BALB/c mice immunized with purified recombinant PCV2 Cap protein.Except the heavy chain type of 4D5 was identified as IgG2b,others were identified as IgG1;The light chains were all kappa.In Western blotting assay,all the monoclonal antibodies (mAbs) couldn't specifically recognize the 47 ku recombinant PCV2 Cap protein,but showed strong specific fluorescence in PCV2 infected PK15 cells in IFA,which indicated that all the mAbs recognized comformational epitope.The neutralization test showed that all the mAbs had neutralization activity.These results laid the foundation for further study of the structure and function of PCV2 ORF2 gene,and establishment of the method for diagnosing PCV2 rapidly and exactly.     

猪圆环病毒Ⅱ型广东分离株全基因组的克隆和序列分析

分离了9株猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）广东地方分离株，并进行了全基因组序列测定；对这9株PCV2广东分离毒株的ORF1和ORF2基因的序列分析表明ORF2的变异程度要比ORF1的变异程度大；对PCV2衣壳蛋白的氨基酸序列同源性比较发现了PCV2毒株间存在1个氨基酸变异程度较大的区域和2个氨基酸变异程度较小的区域，其中前两个区域与两个主要的免疫反应区域相对应；将这9个毒株的全基因组序列与GenBank上收录的18个PCV2毒株的全基因组序列基因进化树分析表明，这9个PCV2广东分离株彼此之间及与国内PCV2分离株、欧洲株之间更接近，而与韩国、中国台湾、日本和美洲毒株之间则稍远，因而在选PCV2疫苗免疫时，建议尽量使用国内生产的疫苗或自制组织灭活疫苗进行免疫。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备

本研究利用已构建的基因工程重组菌表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2编码的Cap蛋白,纯化后作为免疫原,免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。经间接免疫荧光试验(IFA)筛选及有限稀释法进行3次亚克隆后,本试验最终获得5株稳定分泌抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为3D12、4D5、4B9、4C9和4G10。其中4D5为IgG2b亚型,其余4株单克隆抗体均为IgG1亚型,轻链类型均为κ。Western blotting鉴定结果表明获得的5株单克隆抗体均不能特异性的识别47 ku重组PCV2 Cap蛋白;对病毒感染细胞进行IFA试验,结果显示5株单克隆抗体均特异性的识别病毒抗原,表明5株单克隆抗体识别的抗原表位均为构象表位。中和试验结果表明,5株单克隆抗体均有中和活性。本试验结果为进一步探索ORF2基因的结构、功能及建立快速准确的诊断方法奠定了基础。