构树ISSR反应体系的优化与建立

利用正交试验对Taq酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度和模板DNA浓度5个因素进行优化,从而建立了一套适宜构树的ISSR-PCR反应体系.在20 μL的反应体系中,各反应物的最适宜含量为:0.07 U·μL-1 TaqDNA聚合酶、0.35 μmol·L-1ISSR引物、0.3 mmol·L-dNTPs,2.0 mmol·L-Mg2+、1.2 ng· μL-1模板DNA.PCR扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环.     

油茶ISSR反应体系建立及优化

以改进的CTAB高盐法提取油茶嫩叶总DNA,进行简单重复序列间扩增(ISSR)分析,分别测试了退火温度、模板DNA浓度、M g2+浓度、dNTP s浓度、T aqDNA聚合酶用量和是否加入去离子甲酰胺对反应结果的影响.油茶ISSR分析的最适反应体系为:在20μL PCR反应体积中,含20 ng模板DNA,2.5 mm o l.L-1M gC l2,0.2 mm o l.L-1dNTP s,1UT aqDNA聚合酶,0.5pm o l.μL-1引物,1%去离子甲基酰胺.扩增程序为:94℃预变性2 m in;94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸90 s,反应38个循环;最后在72℃延伸7 m in.     

朱砂根ISSR反应体系的建立与优化

分析了不同DNA浓度、Mg2 、dNTP、引物用量对朱砂根ISSR-PCR扩增结果的影响,确立适合朱砂根的ISSR反应体系为:在20μl反应体系中,含1×buffer、30ng模板DNA、随机引物量0.4 μmol/L、dNTP0.15 mmol/L、Mg2 1.75 mmol/L、IUTaq DNA聚合酶.     

桉树的ISSR反应体系建立及优化

以改进的CTAB法提取桉树嫩叶总DNA,进行ISSR分析,分别测试了退火温度、模板DNA浓度、Mg2 浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶用量对反应结果的影响。桉树ISSR-PCR分析较适宜的扩增条件是:25μL PCR反应体积中,buffer(10 mM Tris-HCl,pH9.0,50 mM KCl,0.1%Triton X-100),1.25 U TaqDNA聚合酶,4种dNTPs各0.2 mM,0.4μM引物,2.0mM MgCl2,50 ng模板DNA。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行45个循环:94℃变性45s,52℃~55℃复性45s,72℃延伸90s,循环结束后72℃延伸7min。     

云南松SSR—PCR反应体系的优化研究

本项研究以云南松实生苗幼嫩针叶为材料,采用单因素试验设计,分析云南松SSR—PCR扩增反应体系中各组分对扩增结果的影响,并进一步采用正交试验设计对SSR—PCR扩增反应程序进行优化。结果表明,在15μL SSR-PCR反应体系中包括,1×TaqPCRBuffer,模板DNA用量30ng,Taq聚合酶用量1．0U,0．2mmol L-1dNTPs,3．0mmol·L-1Mg2＋以及正、反引物各0．2μmol．L-1;扩增反应程序为,94℃预变性4min;94℃变性30s,退火30s,72℃延伸45s,35个循环;最后72％延伸10min,4℃保存。该反应条件的建立为开展云南松种质资源SSR分子标记研究提供了参考依据。     

李ISSR反应体系的优化

以李品种杏梅(hybrid)和斯顿莱(Prunus domestica)为试材，研究了PCR反应体系的主要成分及退火温度对李ISSR扩增结果的影响。结果表明：在20μl的反应体系中，模板DNA含量对扩增结果影响不大，在10—80ng均能得到较好的扩增；椰用量对扩增无明显影响；而Primer、Mg^2 的最适浓度分别为0．25μmol／L、0.25mmol/L；Taq酶在0．5～1．0U均能得到好的扩增条带；退火温度在50-52．1℃范围内均能得到清晰的条带。     

贯叶金丝桃ISSR反应体系的建立与优化

以药用植物贯叶金丝桃为研究对象,对其ISSR—PCR反应体系中模板DNA用量、Mg2＋浓度、dNTP浓度、Taq酶含量及退火温度等因素进行了梯度试验,得到最佳ISSR—PCR反应体系,并初步筛选出13条条带清晰、多态性高、重复性好的ISSR引物,为贯叶金丝桃遗传多样性及种质资源鉴定等方面的研究奠定基础。     

柳树SSR反应体系的建立与优化

以簸箕柳(Salix suchowensis Cheng)295-2、绵毛柳(Salix erioclada)716为试材,利用正交设计直观分析法和单因子试验优化柳树SSR-PCR反应体系,通过研究,确定柳树10 μLSSR反应体系为:DNA模板20 ng左右;Taq聚合酶:0.5 U;Mg2+:2.5 mmol/L;dNTP:0.1 mmol/L;引物(R&F):0.3 μmol/L.PCR反应程序为:94 ℃ 2 min;94 ℃ 45 s,(Tm-5)℃ 15 s,72 ℃ 45 s,35循环;72 ℃延伸8 min;4 ℃保温.利用优化的反应体系和程序,对杂种109(簸箕柳295-2×绵毛柳716)的90个单株和柳树的其他几个种进行PCR 反应,验证了其可行性.     

墨兰ISSR-PCR反应体系建立及优化

为建立墨兰的ISSR-PCR反应体系,采用正交试验分析了5个因素（Tag酶浓度、Mg2＋浓度、模板DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度）在4个水平上对 ISSR -PCR反应的影响。结果表明：Tag 酶浓度为1.6U/25μL、Mg2＋浓度为2.4mmol/L、dNTP浓度0.96 mmol/L、Primer浓度为0.64μmol/L、DNA 浓度3.2ng/25μL是墨兰ISSR-PCR最优反应体系。     

紫椴ISSR-PCR反应体系的建立与优化

分别采用单因子试验和正交设计2种方法对影响紫椴ISSR-PCR反应体系的4个因素(Taq酶,Mg2 ,dNTP,引物)在3个水平上进行优化试验.正交设计选用L9(34)方案,采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平.单因子试验分别研究各因素对ISSR-PCR反应的影响情况,找出最佳反应水平.2种方法所得影响因素最佳水平存在差异,通过综合比较与分析,最终建立了紫椴ISSR-PCR的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Taq酶1.0U,Mg2 2.0 mmol·L-1,dNTP 0.20 mmol·L-1,引物0.4μmol·L-1,1×PCR buffer,30 ng模板DNA.在此基础上筛选出14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.     

萱草属植物ISSR-PCR反应体系的优化

以萱草属的3种植物为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的因素Taq酶用量、Mg2 浓度、dNTP用量、引物用量、模板DNA浓度以及退火温度等指标进行单因子筛选和优化,建立了适合萱草属植物ISSR-PCR分析的最佳PCR反应体系:20μL反应体系中Taq酶0.6U、Mg2 1.8 mmol/L、1×Buffer 2 μL、dNTP0.2 mmol/L、引物0.6mmol/L、DNA模板10 ng/μL.扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性40 s,52℃退火45 s,72℃延伸1.50 min,共39个循环;72℃完全延伸5 min,4℃保持.该反应体系及扩增程序扩增谱带清晰,产物量多,为利用ISSR-PCR分子标记研究萱草属植物的遗传多样性提供标准反应条件.     

漾濞泡核桃ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以漾濞泡核桃优株为研究对象,研究其ISSR-PCR反应体系中的5个影响因子(模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度)对PCR扩增效果的影响,从而建立起漾濞泡核桃的最佳ISSR-PCR反应体系。结果表明:模板DNA最佳浓度为50 ng/(25μL),Taq聚合酶浓度为0.75U/(25μL),引物浓度为0.7mmol/L,dNTPs浓度为0.20mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,利用该最佳体系对试验中所选取的样本进行扩增反应。建立了适宜于漾濞泡核桃的ISSR-PCR扩增的最佳体系,该体系的建立为利用ISSR分子标记技术对漾濞泡核桃进行种质资源研究奠定了基础。     

细叶桉ISSR-PCR体系的建立与优化

细叶桉是我国近年来成功引种的耐寒桉树种类之一,但其种源关系难以区分,不利于后续新品种的培育.为给后续的分子水平上鉴定细叶桉种源关系打基础,以细叶桉叶片基因组DNA为材料.分析了能够影响细叶桉ISSR-PCR的主要参数如模板DNA、引物浓度、dNTPs、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、退火温度等6个因素对扩增结果的影响情况,建立了适用于细叶桉ISSR-PCR的反应体系和扩增条件.     

红楠ISSR-PCR反应体系的建立和优化

为建立稳定的红楠ISSR-PCR最佳反应体系,在探索红楠基因组DNA提取的基础上,利用单因子试验和正交试验设计对反应体系进行优化。首先采用单因子试验对Mg²⁺、引物、模板DNA、dNTPs的不同浓度水平进行优化,找出ISSR-PCR反应各因素的最佳浓度;同时为进一步增加结果的可靠性,采用正交试验设计方法 对Mg²⁺、引物、模板DNA、dNTPs 4个因素3个浓度水平进行优化和筛选。综合两种试验方法结果,最终获得了红楠ISSR-PCR最佳反应体系:反应体系为20 μL,Taq酶0.05 U·μL^-1,Mg²⁺ 2.0 mmol·L^-1,模板DNA 1 ng·L^-1,dNTPs 0.3 mmol·L^-1,引物(835) 0.5 μmol·L^-1,1×PCR缓冲液。建立重复性好、稳定性优良的ISSR-PCR反应体系,为下一步红楠群体遗传结构和遗传变异研究提供了技术支持。     

漾濞核桃ISSR-PCR反应体系的建立

以漾濞核桃为研究对象,在从其新叶获得高质量基因组DNA的基础上,通过反应体系和反应程序的试验,建立了漾濞核桃ISSR-PCR反应体系:20 uL反应体系中Mg2 的浓度为0.225 mmol/L,引物的浓度为0.5mmol/L,dNTP的浓度为0.2 mmol/L,TaqDNA聚合酶0.6 U,2.0 uL的10×Buffer和1 uL(40 ng)的模板。反应的基本程序为:95℃预变性600 s,94℃变性30 s,50℃退火60 s,72℃链延伸120 s,35次循环后,72℃延伸420 s。针对不同引物对退火温度进行适当调整,可以获得更为理想的电泳结果;并对云南11个漾濞核桃及杂交品种进行扩增,获得稳定、清晰的电泳结果。     

红花石蒜 ISSR-PCR反应体系的建立

以红花石蒜叶片基因组DNA为模板,分析了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2 的浓度及Taq DNA聚合酶的用量对ISSR-PCR扩增结果的影响.建立了石蒜ISSR分析最优化的反应体系及应用程序:即25 μL反应体系中,有20 ng模板DNA、0.5 μmol·L-1随机引物、150 μmol·L-1 dNTPs、2.0 mmol·L-1 Mg2 、1.0 U Taq DNA聚合酶.反应程序为:94 ℃预变性5 min;然后45个循环:每个循环94 ℃变性45 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸2 min;循环结束后72 ℃延伸7 min.     

桉树ISSR-PCR反应体系的建立及优化

模板DNA、引物、dNTPs、Mg^2＋的浓度,Taq DNA聚合酶的用量以及退火温度是影响简单序列重复区间扩增（ISSR-PCR）结果的主要因素.以桉树叶片基因组DNA为试材,系统地测试了这6个因素对桉树ISSR反应结果的影响.结果表明：最优化的反应体系即20μL反应体系中,含20 ng模板DNA、0.4μmol.L^-1随机引物、0.15 mmol.L^-1dNTPs、2.0 mmol.L^-1Mg^2＋、1.25 U TaqDNA聚合酶.最佳退火温度为55℃;PCR反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,35个循环;72℃再延伸7 min.