山羊乳腺上皮细胞的培养及EGFP基因转化

用组织块培养法获得山羊乳腺细胞原代培养物，并根据山羊乳腺成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同将二者分离纯化。对细胞形态进行光镜观察发现：纯化的山羊乳腺上皮细胞传代至第15代时其生长仍正常。纯化的乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构，呈乳头状，称之为乳球体；乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型，大多数上皮细胞呈短梭形或多角形，呈蜂窝状；部分细胞呈圆饼状，体积较大；部分细胞呈长形。采用电穿孔法将绿色荧光蛋白（EGFP）基因转化体外培养的山羊乳腺上皮细胞，荧光显微镜下观察到EGFP基因的表达。     

整合人乳铁蛋白cDNA山羊胎儿成纤维细胞系的建立

通过转基因动物乳腺表达系统生产重组药用蛋白比微生物发酵系统和动物细胞培养系统具有很多优势;同时,体细胞核移植技术为制备动物乳腺生物反应器开辟了一条新的途径。本实验旨在建立稳定整合人乳铁蛋白cDNA的山羊胎儿成纤维细胞系,为体细胞核移植法制备转基因动物提供可靠的供体细胞。本研究采用RT-PCR获得人乳铁蛋白cDNA,通过Long and Acute PCR扩增山羊β-酪蛋白5’ 端6.5 kb的调控序列,以pEGFP-C1为骨架构建乳腺特异性表达载体 p6.5hLF-EGFP。脂质体介导法转染山羊胎儿成纤维细胞,G418抗性筛选3-4周后,经PCR扩增和报告基因EGFP表达检测,得到稳定整合外源基因的转基因供体细胞系,为制备高效表达人乳铁蛋白的转基因山羊乳腺生物反应器提高可靠的核移植供体细胞。     

一种制备动物乳腺生物反应器的通用表达载体的构建

本文构建了一种用于制备动物乳腺生物反应器的通用表达载体，这种载体含有牛αｓ１－酪蛋白基因的表达调控序列，在５′和３′调控区之间，存在多克隆位点，便于各种不同外源目的基因的插入，两侧存在罕见的单一酶切点，从而可以构建成为理想的转基因结构。     

脂磷壁酸激活奶牛乳腺中NUPR1表达及分布研究

为了探究NUPR1基因在奶牛乳房炎中的表达及分布规律，通过构建脂磷壁酸（LTA）诱导奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）体外炎症模型，以奶牛核蛋白1(Nucleus Protein 1,NUPR1)基因为研究对象，利用免疫组织化学技术（IHC）测定NUPR1在患病奶牛乳腺组织中的分布情况。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白免疫印迹（WB）检测炎症相关因子、NUPR1基因及其上下游基因在奶牛乳腺炎组织及乳腺上皮细胞炎症模型中的表达规律。qRT-PCR和WB结果显示，IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α在乳腺病理组织及细胞炎症模型中均极显著上调表达（P<0.01）,NUPR1在奶牛乳房炎病理乳腺组织及乳腺上皮细胞炎症模型中均显著或极显著上调表达（P<0.05,P<0.01），同时，DNMT1下调表达，KLF4、SESN2和SOCS3基因上调极显著表达（P<0.01）。IHC结果显示，NUPR1主要表达于奶牛乳腺上皮细胞中，并且在奶牛患病乳腺组织中的表达量高于正常组。本研究结果为进一步探究NUPR1基因在乳房炎病理进程中的调控机理提供了试验和理论基础。     

生物反应器填埋场系统中有机垃圾降解特性研究

针对渗滤液回灌型生物反应器填埋场中存在着有机酸积累的问题，试验将产甲烷反应器作为渗滤液回灌前的预处理设施引入生物反应器填埋场，研究了其系统中有机垃圾的降解和产气规律。结果表明，在本模拟试验条件下，有机垃圾在填埋场、产甲烷反应器和生物反应器填埋场系统的总产气量分别为62.1、456和518.1 L，其中产甲烷反应器产气量占生物反应器填埋场系统产气量的88％以上。在产甲烷反应器中产气速率与有机物去除率成正比，回归系数为0.4614 L/g COD。基于生物反应器填埋场系统中有机物降解的特征，建立了其产气动力学模型。该模型可用来初步估算相关生物反应器填埋场系统中填埋垃圾稳定化所需时间及产气量，为系统填埋气的能源化利用提供理论依据。     

植物油体表达体系的研究进展*

介绍了植物种子中油体和油体蛋白(oleosin)的结构特征及其编码基因的调控,阐述了用植物油体表达体系这一新型植物生物反应器生产目的蛋白的研究进展和前景。     

除氮生物反应器净化农田排水的研究及应用潜力分析

农田排水氮素输出是造成水环境污染的重要原因。近年来涌现的生物反应器除氮技术通过在排水末端增设固体碳源装置,将农田排水部分或全部导入后,使其中的硝态氮通过反硝化反应得到去除。该文回顾了国际上现有生物反应器净化农田排水的研究进展,并分析了农田生物反应器在中国南方湿润区应用的潜力。现有研究结果表明,除氮生物反应器可以有效净化排水水质,平均每年可降低23%～98%的氮素负荷;是一种占地面积少且水质净化效率高的农田控污措施。生物反应器的除氮效果与农田排水过程密切相关,并受到介质特性、入流、出流条件以及环境因子等的影响。中国南方平原作物生长及排水过程相对集中,气象等环境条件非常适于生物反应器的反硝化反应。如何因地制宜确定反应器安装位置与设计尺寸,筛选填料介质,并通过对排水过程的调控来优化生物反应器的除氮效果是需要进一步研究的问题。生物反应器系统后期管理与内部反应动态监测是保证系统正常运行的重要手段。利用生物反应器来净化农田排水具有良好的应用前景,该文可为推动生物反应器在中国的应用研究以及排水污染治理提供理论依据与技术支撑。     

利用RNA沉默抑制子HC-Pro提高基因表达的策略

利用植物生物反应器生产药用蛋白具有独特的发展优势,但外源基因在受体内会发生基因沉默现象而影响基因的表达。由于基因沉默抑制子能有效抑制外源基因的沉默反应,本研究利用沉默抑制子蚜传辅助因子(helper component-proteinase,HC-Pro)转基因烟草有效提高了外源基因的表达。采用叶片注射法将携带表达载体p35S-30B-GFP的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)重悬液分别侵染野生型烟草(Nicotiana bentamiana)和HC-Pro转基因烟草(N.bentamiana),通过蛋白电泳检测和Western blot检测技术对绿色荧光蛋白(GFP)表达进行比较。研究结果表明,与野生型烟草Nb相比,HC-Pro转基因烟草中GFP的表达水平显著增加。本研究为基因沉默抑制子在植物生物反应器中的应用提供了理论依据。     

牛MEN1基因真核表达载体的构建及其表达分析

多发性内分泌腺瘤致病因子1 (multiple endocrine neoplasia Ⅰ,MEN1)参与乳腺发育与泌乳行为的调控.本研究克隆了牛(Bos taurus) MEN1基因(bMEN1)的全长cDNA,并在不同细胞中检测bMEN1mRNA及其编码蛋白menin的表达情况.根据GenBank中bMEN1基因序列,设计特异性引物,用qRT-PCR方法得到附带EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位点的bMEN1片段,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(A)中.体外转染物种同源性细胞牛乳腺上皮细胞(bovine mammary gland epithelial cell,MAC-T)和异源性细胞中国仓鼠(Cricetulus barabensis)卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)、小鼠(Mus musculus)成肌细胞(mouse myoblast cells,C2C12),利用qRT-PCR和Westem blot技术检测转染前后bMEN1 mRNA和蛋白menin的表达.双酶切和基因测序结果表明,成功构建了bMEN1基因的真核表达载体pcDNA3.1-myc-his-bMEN1.所建立的转染体系可以使目的基因bMEN1在3种不同细胞中成功表达mRNA和目的蛋白,转染后24 h都达到最高表达量,并达到极显著水平(P＜0.01),之后逐渐降低.其中,CHO细胞中的转染24 h后bMEN1 mRNA和menin蛋白的表达量分别是对照的28 415倍和5.65倍.本研究建立了bMEN1基因的真核表达载体及其转染体系,能够在不同细胞中成功表达,为体外研究MEN1基因对于乳腺的调节功能及其对于机体代谢的调节机制提供了一种工具和技术体系.     

我国生物基因资源的科学保护和持续利用战略

生物基因资源是所有的生命科学研究及其生物技术产业的物质基础。对生物基因资源的科学保护和持续利用的战略意义以及我国在生物基因资源科学保护和开发利用的现状进行了分析，并针对中国的具体情况，提出了加强我国生物基因资源保护和管理的具体对策与建议。     

生物反应器在市政污水处理中的应用研究概况

生物反应器是指在适宜条件下,利用生物体所具有的生物功能,通过自身的代谢等生化反应来获得目标产物的设备。对用于市政污水脱氮除磷处理的生物反应器的种类、特点、处理效果、适用范围,生物反应器在污水处理中的应用前景进行了综述。     

转基因羊研究进展

转基因动物已成为当今生命科学发展的热点，其中转基因羊的研究又是转基因动物中较为活跃的领域。自1985年用显微注射法获得了第1只转基因羊以来，随后有关转基因羊获得成功及取得突破的相关报道逐渐增多；同时转基因羊的研制目的也从当初的转基因育种逐渐倾向于乳腺生物反应器，并亦取得显著成效。本文就此作一简要综述。     

猪乳铁蛋白N-叶基因PLF-N在大肠杆菌中的克隆、表达及特性分析

从泌乳15d的约克夏母猪乳腺组织中提取总RNA，用RT-PCR技术扩增PLF-N基因，获得1条1038bp的目的片段。将目的基因克隆到质粒载体pET-28a（＋）中，并转化大肠杆菌（Eschetichia coli）感受态细胞BL21（DE3），经IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明，PLF-N基因在大肠杆菌BL2l中表达，表达产物分子量约为42kD。     

高温诱导体外培养奶牛乳腺上皮细胞的应激响应

实验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究不同时间高温(42℃)热处理对细胞热休克蛋白HSP、细胞凋亡、乳脂肪和乳蛋白合成相关基因mRNA表达丰度的影响.结果发现,热休克转录子hsf-1和热休克蛋白基因hsp27、hsp70和hsp90在高温处理0.5 h后mRNA表达上调,其中hsp70转录水平有急剧上调过程,且随热处理时间延长均表现出先上升后下降的趋势;标志细胞凋亡的Bax基因从处理的0.5 h开始mRNA表达下调,随后升高;但细胞凋亡Bcl-2 mRNA表达上调;在检测的热处理过程中,αS1-酪蛋白(CSN1S1)基因转录先上调后下降,而β-酪蛋(CSN2)和嗜乳脂蛋白(BTN)基因转录均下调;与脂肪酸合成和调控相关的基因乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)、过氧化物酶激活受体.-γ(PPARG)和固醇调节元件转录因子-1(SREBF-1)基因表达显著上调,而过氧化物酶激活受体-α(PPARA)基因mRNA转录没有明显变化.本实验结果证明热应激诱导了奶牛乳腺上皮细胞的应激反应,对细胞的乳蛋白和乳脂肪合成功能产生了显著影响,细胞产生热耐受.     

基于CFD数值模拟的平板式微藻光生物反应器比较

为进一步提高微藻光生物反应器的混合与传质性能,在已有多节隔板平板式光生物反应器的基础上设计多级进气,新建立了多级进气多级隔板平板式光生物反应器。构建了普通反应器、多节隔板反应器、多级进气反应器并利用计算流体动力学模拟研究了3种反应器的流动与传质特性。结果表明,模拟结果与相关试验测量值吻合良好,多级进气结构可以带来更明显的级内环流现象,从而使该反应器在液体平均速度、死区比、湍动能、湍动能耗散率、气含率、液相传质系数等性能参数上较前2种反应器均有很大提高。在适合微藻培养的通气率0.4~0.8(每分钟通入反应器的气体体积与反应器实际装液体积之比)内,该反应器的混合及传质性能均表现优异。该工作为平板式生物反应器的设计及优化提供了新的方向。     

碱性成纤维细胞生长因子在苜蓿中的表达

为了降低bFGF（basic fibroblast growth factor）的生产成本,结合植物生物反应器的优点,就bFGF在转基因苜蓿中的表达进行了探索。将bFGF插入植物表达载体pBⅡ21中,获得了含有bFGF基因的植物表达pBIcbFGF,再将pBIcbFGF利用冻融法转到农杆菌中。利用农杆菌介导法将基因转化保定苜蓿,转基因苜蓿在TM-1培养基＋20mg／L卡那霉素（Kan）＋200mg／L特美汀（Tim）中诱导分化,在生根培养基中生根,获得再生植株。再生植株通过PCR检测、RT—PCR及Western blot证实外源基因已经在苜蓿中成功表达。获得含有目的蛋白的阳性植株。为苜蓿作为植物生物反应器生产bFGF奠定了理论及技术基础。     

绵羊GlyCAM-1基因克隆、核苷酸变异及其组织表达分析

糖基化依赖细胞粘附分子(GlyCAM-1)是粘液素(mucin)糖蛋白家族的成员,是乳腺细胞合成的一种乳脂球膜蛋白(MFGMPs)的重要组成部分。GlyCAM-1在乳腺发育和泌乳中发挥着重要作用,为探究该基因的序列特征、核苷酸序列变异和表达特征,以高泌乳量的小尾寒羊(泌乳高峰期和空怀期)和低泌乳量的甘肃高山细毛羊(泌乳高峰期)的乳腺组织为研究对象,利用克隆测序、RT-qPCR、生物信息学等方法克隆绵羊GlyCAM-1基因的编码区,分析GlyCAM-1的理化性质和蛋白质结构,并检测GlyCAM-1基因的组织表达特性。结果表明,绵羊的GlyCAM-1基因CDS区全长465 bp,编码154个氨基酸。测序结果表明,在该基因CDS区检测到7个SNPs,其中2个为同义突变,5个为错义突变。GlyCAM-1二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,延伸链则散布于整个蛋白质结构中。String分析结果表明,GlyCAM-1蛋白与CD34、MadCAM-1都作为L-选择素(L-selectin)的配体发挥作用;RT-qPCR结果表明,GlyCAM-1基因表达具有组织特异性、品种特异性和时空特异性,乳腺、心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、卵巢和背最长肌8个组织中,GlyCAM-1基因只在乳腺和肺脏组织中表达,在其余6个组织中均不表达,其中乳腺中的表达量最高;在泌乳高峰期的乳腺组织中,GlyCAM-1在高泌乳量的小尾寒羊中的表达量显著高于甘肃高山细毛羊(P<0.05);在小尾寒羊的乳腺组织中,GlyCAM-1在泌乳高峰期的表达量极显著高于空怀期(P<0.01)。本研究结果丰富了绵羊基因组数据,为深入研究GlyCAM-1基因的泌乳生物学功能及其机理提供了基础数据。     

甘薯原料气升式生物反应器发酵生产单细胞蛋白

以甘薯为原料,采用少孢根霉ＡＳ３．４３９２与树状假丝酵母混合发酵工艺,在无筛板、带一块和带二块筛板的气升式生物反应器中发酵４８ｈ后的干基粗蛋白的含量分别为４６．４％、４７．１％、４７．７％。试验结果表明,气升式生物反应器的发酵结果优于机械搅拌式生物反应器,而带筛板的气升式生物反应器又优于不带筛板的气升式生物反应器。在氧传递性能考察中,发现气升式生物反应器内加装筛板可以有效地强化氧传递     

SOD2基因在临床型乳房炎绵羊乳腺组织中的表达与定位

超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)基因作为内源性抗氧化防御屏障重要组成部分,在抗肿瘤、抗炎症、抗衰老、预防疾病等方面发挥着重要的作用。为探讨SOD2基因在临床型乳房炎与正常绵羊(Ovis aries)乳腺组织中的表达与定位情况。实验选取临床型乳房炎与正常绵羊各3只,采集乳腺组织,应用荧光定量PCR和Western blot方法检测SOD2 mRNA与蛋白在正常与临床型乳房炎绵羊乳腺组织中的表达情况,并应用免疫组织化学方法对正常与临床型乳房炎绵羊乳腺组织中的SOD2蛋白进行定位。结果显示,临床型乳房炎与正常绵羊乳腺组织中均有SOD2基因的表达,且临床型乳房炎乳腺组织中该基因的mRNA与蛋白表达均极显著高于对照组(P0.01);免疫组织化学染色发现,正常与临床型乳房炎绵羊乳腺组织中的乳腺上皮细胞均有SOD2阳性表达,且临床型乳房炎绵羊乳腺组织中该蛋白的阳性反应较强。研究结果表明,临床型乳房炎绵羊乳腺组织中SOD2 mRNA和蛋白表达均上调,这为进一步研究该基因与绵羊乳房炎发病机理提供了基础性的数据资料。     

牛乳腺细胞系BME—L1β—酪蛋白分泌的诱导及人促红细胞生成素（h …

用悬浮胶元及生乳激素诱导ＢＭＥ－Ｌ１泌了β－酪蛋白，证明了ＢＭＥ－Ｌ１所具有上皮性质，用质脂体介导法向ＢＥＭ－Ｌ１转入含人促红细胞生成素基因的质粒ｐＢＣＥ，经生乳激素及悬浮胶元诱导，这些细胞短暂表达ｈＥＰＯ。讨论了影响乳腺细胞内源乳蛋白基因及外源基因表达效率的因素。