生物细胞色素P450的研究进展

简要介绍了生物细胞色素P450分布的多样性、P450的功能、P450在不同领域的研究现状与进展。鉴于P450的研究无论在理论上探索生物的生理代谢、选择进化和 生物与环境的关系方面，或在环境保护、农业生态、生物防治、作物基础工程和医药卫生等应用方面，都有广泛的实践意义，因此，应该受到更大的关注和重视。     

砀山酥梨细胞色素P450的基因组学分析

细胞色素P450在植物的苯丙烷类、生物碱和萜类等生物合成中起着非常重要的作用。为了更好地了解砀山酥梨中P450的种类和数量,利用砀山酥梨基因组的氨基酸和c DNA数据库对P450基因进行筛选,分析砀山酥梨全基因组中P450基因的种类、进化关系、基因的物理定位、以及二级结构元件。结果显示,在砀山酥梨基因组中发现并初步确定了226个P450基因,通过基因的定位分析确定了226个基因分布在17条染色体上,其中除了4、5、9号染色体上无基因簇分布外,其他的染色体都有基因簇的分布。通过基因结构和进化树之间的比较,进一步确定了基因结构和进化之间的相互联系。二级结构的分析表明,砀山酥梨P450蛋白序列同样具有P450蛋白特征性结构域。本研究结果为砀山酥梨P450基因功能的深入分析奠定了基础。     

油菜叶片衰老相关基因的分离：细胞色素P450cDNA的克隆和序列 …

通过绿叶和衰老叶片ｃＤＮＡ的缩减杂交和差别筛选，富集并分离了缩减ｃＤＮＡ文库中与油菜叶片衰老有关的基因片段。以目的基因片段为探针，通过筛选油菜衰老叶片的ｃＤＮＡ文库，分离了油菜叶片衰老阶段表达增强的全长ｃＤＮＡＬＳＣ４６。     

小鼠卵巢内细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶的发生

利用免疫组织化学技术探讨了细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶[P450（SCC）]在小鼠卵巢内的发生时相，研究发现15日龄的胎鼠卵巢内即存在P450（SCC）的免疫染色；出生前后卵巢内的基质细胞和前体颗粒细胞中均可检测到P450（SCC）的免疫染色，伴随卵泡发育，产后10d的小鼠卵巢次级卵泡膜细胞开始出现P450（SCC0的免疫染色，并随着日龄的增加而逐渐增强；临近性成熟小鼠卵巢内较大的有腔卵泡颗粒细胞也开始出现P450（SCC）的免疫染色。研究结果初步阐明了P450（SCC）在卵巢内的发生时相和表达模式；产后小鼠卵巢内P450（SCC）伴随次级卵泡膜细胞的形成而发生；优势卵泡排卵前的成熟发育进程中壁层颗粒细胞逐渐获得表达P450（SCC），进而分泌孕酮的能力。     

4种鱼类肝脏细胞色素P450对毒死蜱、对硫磷及马拉硫磷的脱硫代谢

以毒死蜱、对硫磷及马拉硫磷为供试农药,以斑马鱼、剑尾鱼、麦穗鱼及太阳鱼为供试生物,研究了3种农药对4种鱼的急性毒性,4种鱼肝细胞色素P450对3种农药的脱硫代谢作用及两者之间的相关性。结果表明,毒死蜱对于上述4种鱼的96hLC50分别为1.94、0.171、0.0273、0.0681mg·L^-1;对硫磷为2.6、0.0559、1.78、1.02mg·L^-1;马拉硫磷为7.07、0.907、6.03、0.172mg·L^-1。4种鱼肝脏P450对于毒死蜱代谢的Vmax/Km值分别为1.67×10^4、2×10^4、5×10^4、2×104min^-1;对于对硫磷代谢的Vmax/Km值分别为2×10^4、5×10^5、1.11×10^5、1.43×10^5min^-1;对于马拉硫磷的值分别为5×10^3、5×10^4、2.5×10^3、1.67×10^4min^-1。96hLC50值与Vmax/Km值大体呈负相关,其中毒死蜱的相关性较弱,对硫磷及马拉硫磷的相关性较强（R^2值分别为0.2181、0.8490、0.5102）。研究结果说明P450在鱼类耐药性形成过程中发挥了阻碍作用。     

油菜叶片衰老相关基因的分离细胞色素P450 cDNA的克隆和序列分析

通过绿叶和衰老叶片cDNA的缩减杂交和差别筛选,富集并分离了缩减cDNA文库中与油菜叶片衰老有关的基因片段.以目的基因片段为探针,通过筛选油菜衰老叶片的cDNA文库,分离了油菜叶片衰老阶段表达增强的全长cDNA LSC46.DNA序列分析结果表明,LSC46可读框架全长由1509个碱基组成,可以编码503个氨基酸残基,它的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与拟南芥菜依赖于单加氧酶的细胞色素P450的相应序列相比,分别有84.23%和83.50%的同源性.     

不同鳞翅目昆虫细胞色素P450基因(CYPs)的比较基因组学分析

细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)涉及许多昆虫生理功能,包括对信号分子的代谢、宿主植物的适应性及杀虫剂的抗性等.鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的种类仅次于鞘翅目(Coleoptera),包含了大量的农业害虫.根据鳞翅目烟草天蛾(Manduca sexta L.)的基因组数据,开展CYPs的全基因组学分析,在该基因组中发现了110个可能的CYPs,可分为29个家族,其中有大量CYPs以串联重复形式排列.将分析所得序列与蝶类昆虫黑脉金斑蝶(Danaus plexippus L.)和模式昆虫家蚕(Bombyx mori L.)的CYPs进行比较基因组学分析,结果表明,在CYP2与线粒体集团(clan)中存在12对CYPs直向同源基因,而CYP3与CYP4集团的CYPs呈现种属特异性扩增趋势.通过比较分析鳞翅目昆虫与其他非鳞翅目昆虫的CYPs发现,鳞翅目昆虫之间不仅存在更多的直向同源基因对,而且鉴别出的直向同源基因群也更多,但出现新的家族与亚家族数量相对较少.不同鳞翅目昆虫基因组中的CYPs存在相当广泛的线性保守现象.这些不同昆虫间的比较基因组学分析将促进鳞翅目昆虫CYPs的研究,也有助于害虫治理新靶标的选择.     

洋甘菊细胞色素P450还原酶基因(CPR)的分子克隆及表达分析

细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)是生物体内氧化系统中的电子供体,在细胞色素P450介导的氧化还原反应中起限速作用,是氧化反应中的关键酶。本研究根据已经报道的其他植物的CPR基因设计简并引物,并在洋甘菊(Matricaria recutita L.)中克隆CPR基因的部分片段,然后通过RACE扩增得到CPR基因全长。结果表明,克隆得到洋甘菊的CPR基因,提交至GenBank,得到登录号KJ004519,其cDNA全长2 272 bp,包含2 106 bp的编码区,翻译701个氨基酸序列;生物信息学分析表明,洋甘菊与青蒿(Artemisia annua)的亲缘关系最近,CPR基因氨基酸序列有94%的相似性,CPR蛋白质结构包括结合P450结构域和辅因子黄素腺嘌呤二核甘酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和黄素单核甘酸(flavin mononucleotide,FAM)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)结构域;通过qRT-PCR检测CPR基因在洋甘菊开花阶段舌状花冠、管状花冠、茎和叶中的表达量,结果表明,CPR mRNA转录本积累量在管状花冠中表达量最高,是叶中表达量的20多倍,在舌状花冠和茎中有微量表达量。本研究首次克隆了洋甘菊中CPR基因,CPR基因是植物萜类的氧化修饰过程中关键酶,为进一步研究细胞色素P450氧化酶系在洋甘菊中萜类的生物合成途径中的具体作用提供了基础资料。     

蓖麻细胞色素P450基因片段的克隆及RNAi表达载体的构建

采用PCR方法克隆了蓖麻细胞色素P450基因的正反2个片段。正向片段长为525个碱基,反向片段长为421个碱基。经测序分析,得到的正向基因片段和反向基因片段与GenBank上的蓖麻细胞色素P450基因（XM₀02525863.1）的碱基同源性分别为98.85%和99.51%。利用载体pHANNIBAL和限制性内切酶将正反2个片段连接成具有发夹结构的中间载体pHAN-P450S-P450A,然后将中间载体和表达载体pBI-121连接,构建了P450基因的RNAi植物表达载体,为利用RNA干扰抑制P450基因表达的研究奠定了基础。     

苦荞细胞色素CYP81家族同源基因FtP450-R4的克隆、分子鉴定及其功能分析

细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP450)是高等植物中最大的酶蛋白家族之一,广泛参与植物的次生代谢和抗逆生理.本研究采用同源克隆和cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNAends,RACE)技术,获得苦荞(Fagopyrum tataricum) CYP81家族同源基因FtP450-R4 (GenBank登录号:KM271986).FtP450-R4 cDNA全长1770bp,5'-UTR为49 bp,3'-UTR为194bp,ORF为l 527 bp,其ORF序列可编码508个氨基酸残基的蛋白.生物信息学分析表明,FtP450-R4蛋白通过N-端4～24位氨基酸残基定位于内质网,与F3'H (flavonoid 3'-hydroxylase)、I2'H (isoflavone 2'-hydroxylase)和其他CYP450的同源性在44％～46％之间;多重序列比对显示,FtP450-R4具有CYP450中经典的基序和保守序列,但不含F3'H的特征基序(GGEK);系统进化树分析显示,FtP450-R4与拟南芥(Arabidopsis thaliana) CYP81家族和I2'H聚为一大簇,说明其可能参与苦荞黄酮类化合物的羟化或对逆境胁迫的应答.UV-B、寒冷和干旱均能引起FtP450-R4在苦养子叶中表达量的显著变化,而在胚轴中其表达量变化不显著.利用大肠杆菌(Escherchia coli) BL21 (DE3)菌株对FtP450-R4蛋白进行了可溶性表达,活性鉴定表明,重组FtP450-R4蛋白能以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)和山奈酚为底物进行酶促反应,具有生物学活性.本研究可为了解CYP450在黄酮合成代谢中的功能,明确苦荞黄酮代谢调控的分子机制提供了基础资料.     

蚯蚓（Eiseniafetida）细胞色素P450及抗氧化酶系对环境浓度苯并（a）芘的响应

以赤子爱胜蚓（Eiseniafetida）为供试生物,草甸棕壤为供试土壤,以蚯蚓微粒体细胞色素P450含量、抗氧化酶系以及谷胱甘肽转移酶活性为指标,进行了土壤中苯并（a）芘[B（a）P]暴露与酶活性的量-效关系研究。结果表明,在接近沈抚灌区实地污染状况B（a）P（0．1～2．0mg·kg-1）暴露下,第1、3、7以及第14d取样时,P450和SOD有较好的响应：SOD在第1、3d显著升高,而在第7、14d时降低;P450总体表现为低浓度B（a）P诱导下降低,高浓度下升高的趋势。CAT、POD以及GST的敏感性相对较差。比照其他4个指标,蚯蚓P450的敏感性更为优异,具有较好的应用前景。指标敏感性总体表现为：P450〉SOD〉CAT／POD〉GST。