绵羊冷冻胚胎移植成功

以成年寒羊母羊做供、受体。使用 FSH(300单位)和 LH(150单位),进行供体超数排卵,并在发情周期的第6～8天(发情开始当天=0天)用杜氏磷酸盐缓冲液(PBS)+5%失活犊牛血清,冲洗子宫角手术采卵。只有形态正常的胚胎用于冷冻。胚胎冻前分6步(0.25M、0.5M、0.75M、1.0M、1.25M 和1.5M,每种浓度停留7～10分钟)添加抗冻剂(DMSO)。解冻后也分6步(1.5M、1.25M、1.0M、0.75M 和0.25M,每种浓度停留10分钟)除去 PBS 液中的 DMSO。胚胎在盛有0.25～0.3毫升 PBS 液(Whitting-ham,1971)的安瓿(容量1.0毫升)中冷冻,PBS 液含1.5M 的 DMSO。自1979年8月24日至12月27日,胚胎的冷冻和移植试验分三批进行。第一批胚胎是按 Willadsen(1976)冷冻羊胚胎的方法冷冻的,并降温至-120℃时将安瓿移入液氮。安瓶从-80℃--5℃,以12℃/分钟的速度解冻,从-5℃放入手中快速升温解冻。第二和第三批,胚胎是按 Willadsen(1978)所述及的牛胚胎冷冻和解冻方法进行的,并降温至-60℃将安瓿直接投入液氮。将安瓶放入-50℃的酒精浴中,以4℃/分钟的速度解冻至-10℃。从-10℃将安瓿放入手中快速解冻。第三批试验的受体根据母羊的健康和繁殖情况进行了挑选。共49个胚胎(47个形态正常的和2个形态异常的)移入23只受体,4只母羊妊娠。其中一只受体早产,羔羊死亡;一只受体母羊产了3只羊羔,共产了五只羊羔。三批试验的受体妊娠率和胚胎成活率分别如下:0%(0/8)、0%(0/18)、11.1%(1/9)、6.2%(1/16)和50%(3/6)、33.3%(5/15)。     

小鼠卵母细胞冷冻技术研究

采用PBS作为冷冻基础液,分别用甘油和二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护液,在程序化冷冻保存和玻璃化冷冻保存条件下,研究小鼠生发泡期(GV期)卵母细胞的抗冻能力。结果表明,2种冷冻方法对小鼠GV期卵母细胞解冻后形态正常率和存活率无显著影响(P>0.05)。冷冻保护剂种类对小鼠GV期卵母细胞解冻后形态正常率无显著影响(P>0.05);但对存活率有显著影响,玻璃化冷冻采用二甲基亚砜作为冷冻保护液效果极显著优于甘油(P<0.01)。以冷冻效果较好的二甲基亚砜作为冷冻保护液,采用玻璃化冷冻不同发育阶段(GV期和MⅡ期)的小鼠卵母细胞,解冻后形态正常率无显著差异(P>0.05),但存活率GV期要显著优于MⅡ期卵母细胞(P<0.05)。     

猪胚胎冷冻移植成功

将哺乳类动物的胚胎冷冻保存在液氮中的试验已经在一些动物成功,如小鼠(Whit-tingham等,1972),牛(Wilmut和Rowson,1973)、绵羊(Willadsen等,1976)、山羊(Bilton和Moor,1976)和马(Yamamoto等,1982)。牛的冷冻胚胎已经商业化生产。然而,猪胚胎的冷冻和解冻还未获得成功。据报道,猪的胚胎对于低温,即使是+10℃(Wil-mut,1972;Niemann,1985)都极敏感。本研究是检验由桑葚胚到孵出期囊胚各胚龄猪胚胎冷冻-解冻后能否存活。采用有性周期的8～24个月龄、体重120～     

哺乳动物胚胎冷冻保存的研究进展

哺乳动物胚胎的超低温保存技术对于动物种质资源的保存和良种家畜的国际交流具有重要意义,是胚胎移植、体外受精、转基因和克隆等胚胎生物技术不可分割的组成部分。1972年,英国学者Whittingham等人首次利用慢速冷冻法保存小鼠胚胎获得成功。此后许多学者对冷冻方法进行了广泛的研究。然而,在胚胎冷冻和解冻过程中都存在许多会使胚胎受到损伤的因素,如:抗冻保护剂的毒性,冷冻损伤,细胞内冰晶的形成,破裂损伤,渗透压引起的膨胀。因此,使用不同的冷冻和解冻法应避免或减少胚胎受到损伤,以提高胚胎解冻后的存活率。1抗冻保护剂和冷冻溶液在哺乳…     

不同精液冷冻程序对杏花鸡精液冷冻效果的影响

本试验选择BPSE(Blesville Poultry Semen Extender)作为精液稀释液,以二甲基乙酰胺(dimethylacetamide,DMA)和乙二醇(ethylene,EG)2种试剂作为抗冻剂,分别以不同的质量浓度进行组合,对杏花鸡精液冷冻保存的平衡时间、冷冻方式和解冻温度以及时间等影响精液冷冻效果的关键因素进行了研究。结果如下:(1)质量浓度分别为4%DMA和6%EG的抗冻剂对精液保护效果较好,精子冻后活力分别为0.466和0.464,两者之间差异不显著;(2)选择质量浓度为6%EG为抗冻剂,平衡8 min后的精子活力最高,为0.542;(3)在(2)的基础上,选用颗粒冷冻和细管冷冻2种方式冷冻,分别在水浴锅里以40℃、55℃、70℃3个温度解冻。结果表明,用颗粒冷冻在55℃水浴锅里解冻的精子活力最高,为0.482;(4)采用颗粒冷冻和细管冷冻2种方式对新鲜精液冷冻解冻后与新鲜精液一起进行人工授精,捡蛋入孵后统计受精率,细管冷冻、颗粒冷冻以及鲜精的受精率为0、0和92.52%。结论:在本试验中,以6%EG为抗冻剂,在5℃下平衡8 min,用颗粒冷冻的方法在55℃恒温水浴箱内解冻可以使解冻后的精子达到最大的存活率;授精试验效果不佳,表明该程序虽然可以使精子存活,但是对精子有损害作用。     

小鼠囊胚和扩张囊胚玻璃化冷冻保存的研究

以6M甘油+6.5%PVP(V1)和8MEG+7%PVP(V2)为玻璃化溶液,采用细管法和OPS一步法对小鼠囊胚进行冷冻.结果表明:胚胎在玻璃化溶液中平衡20S显著高于平衡60S后的存活率(P＜0.05);蔗糖四步法解冻后的发育率与蔗糖三步法冷冻解冻后的发育率差异不显著(P＞0.05);用OPS三步法冷冻后(V2)的小鼠囊胚的体外发育率显著高于细管法和OPS一步法冷冻后的发育率(P＜0.01);在OPS三步法冷冻过程中,平衡时间对胚胎冷冻后的发育率有一定的影响.     

家畜卵和胚胎冷冻的现行方法及有待研究的问题

近17年来,采用建立起来的牛非手术采卵及冷冻方法,已能将牛桑葚胚和囊胚冷冻,并获得较高的存活率。现在试验中和商业上牛胚胎冷冻大多数是采取控制降温和解冻的程序。解冻后存活率按形态评定可达90％～100％,非手术移植的妊娠率为60％。绵羊、山羊和马的桑葚胚和囊胚用控制降温和解冻程序也能有效的冷冻。简化的控制降温和解冻程序的一步法用于牛胚胎,妊娠率可达50％。此法免去了解冻后较繁琐的脱除冷冻保护剂和胚胎评定过程。玻璃化法和快速冷冻法是较先进的方法,可大大缩短胚胎冷冻时间,而且无需复杂的冷冻设备。不过,迄今家畜胚胎冷冻的结果还是有待提高的,尽管牛、绵羊、山羊桑葚胚和囊胚用玻璃化法冷冻已经成功,移植后产了仔。另外,卵母细胞、早期胚胎、显微手术(切割、克隆、活组织检查)后的胚胎、猪胚胎冷冻成功率还很低。因此,为使胚胎移植技术能在生产中应用和开展胚胎显微操作、体外受精、克隆和基因转移之类生物技术的试验及应用,很有必要加强研究建立起更为有效的胚胎冷冻解冻方法。     

不同冷冻方法对水牛体外生产胚胎冷冻效果的研究

本研究采用不同来源的体外生产胚胎(屠宰场卵巢IVF胚胎,OPU-IVF胚胎,SCNT胚胎),系统研究了不同冷冻方法对水牛体外生产胚胎冷冻效果的影响,以完善水牛体外生产胚胎冷冻方法,进一步提高胚胎冷冻效果。试验选用6～7日龄囊胚分别用不同的冷冻液和不同冷冻方法进行胚胎冷冻。玻璃化冷冻液分别为40%EG、25%EG+25%DMSO和20%EG+20%DMSO+0.5 mol/L蔗糖;程序化冷冻液分别为10%甘油和0.05 mol/L海藻糖+1.8 mol/L EG+0.4%BSA。结果表明:(1)在玻璃化冷冻中,无论何种胚胎不同冷冻液的冷冻效果有明显的差异,但均以20%EG+20%DMSO+0.5 mol/L蔗糖作为冷冻液的冷冻效果最好,并且高于程序化冷冻的存活率;而对于程序化冷冻,用10%甘油作为冷冻液,屠宰场卵巢IVF胚胎的冷冻后存活率略高于用0.05 mol/L海藻糖+1.8 mol/L EG+0.4%BSA的冷冻后存活率,但差异不显著(P>0.05)。(2)VF胚胎利用程序化冷冻胚胎解冻后,在0～24 h内有76.5%胚胎复活,高于玻璃化冷冻的复苏率(48.9%)(P<0.05);而与此相反,在24～48 h内,玻璃化冷冻胚胎的复苏率(42.6%)则高于程序化冷冻(23.5%)(P<0.05)。综上所述,各种来源的水牛体外生产胚胎均可进行冷冻保存,应用玻璃化冷冻的效果好于程序化冷冻,且以20%EG+20%DMSO+0.5 mol/L蔗糖作为冷冻液进行玻璃化冷冻效果最好,但程序化冷冻后的胚胎复苏速度明显快于玻璃化冷冻的速度。     

小鼠囊胚和扩张囊胚玻璃化冷冻保存的研究

以6M甘油+6.5%PVP(V1)和8MEG+7%PVP(V2)为玻璃化溶液,采用细管法和OPS一步法对小鼠囊胚进行冷冻。结果表明:胚胎在玻璃化溶液中平衡20S显著高于平衡60S后的存活率(P<0.05);蔗糖四步法解冻后的发育率与蔗糖三步法冷冻解冻后的发育率差异不显著(P>0.0 5);用OPS三步法冷冻后(V2)的小鼠囊胚的体外发育率显著高于细管法和OPS一步法冷冻后的发育率(P<0.01);在OPS三步法冷冻过程中,平衡时间对胚胎冷冻后的发育率有一定的影响。     

绵羊玻璃化冷冻胚胎直接移植试验研究

应用EFS40玻璃化液对6.5～7日龄的绵羊胚胎进行玻璃化冷冻及解冻后直接移植试验.结果:桑椹胚、囊胚冷冻解冻后移植的妊娠率分别为37.50%(3/8)和54.55%(6/11),胚胎存活率分别为33.33%(3/9)和50.00%(6/12),差异均不显著(P＞0.05);胚胎解冻后用0.5 mol/L蔗糖脱防冻剂与直接用胚胎存放液脱除防冻剂的妊娠率分别为44.44%(4/9)和50.00%(5/10),胚胎存活率分别为40.00%(4/10)、45.45%(5/11)差异不显著(P＞0.05);10枚解冻后的胚胎细管内脱防冻剂后,直接装管移植给8只受体,妊娠率为50.00%(4/8),胚胎成活率为40.00%(4/10),与同期常规冷冻解冻组相比无显著差异(P＞0.05).     

在生产条件下牛冷冻胚胎直接移植的效果

牛冷冻胚胎解冻后能直接移植给受体牛的胚胎冷冻保存方法,对在商业条件下应用胚胎移植技术最有价值。传统冷冻法通常在胚胎解冻后用蔗糖溶液分步稀释抗冻保护剂,在显微镜下检查胚胎品质,合格者方能移植。与此相比,直接移植法简化了移植前胚胎的处理,可消除由于稀释抗...     

公猪精液的冷冻(摘要)

一、稀释液成分、保护剂种类和解冻方法对精子活率的影响 S.Salamon,I.Wilmut和C.Polge 为了探讨糖和多元醇(肌醇、卫矛醇)、甘油、低分子多元醇和细胞“非渗透”剂(Cellnon-permeating”agents)等结晶保护剂以及解冻方法对颗粒冷冻精液解冻后精子活率的影     

F1代和ICR小鼠体外、体内受精后8-细胞胚胎玻璃化冷冻的比较

探讨了F1代(♀ICR×♂BALB/C6J)和ICR小鼠体外受精及体内受精两种不同来源获得的8-细胞胚胎玻璃化冷冻效果。不同来源的小鼠胚胎在预热到37℃1MDMSO溶液中处理后,转移到冷冻管中5min然后加入DAP213,并在0℃平衡5min后冷冻。体外受精及体内受精两种方法获得的F1代小鼠8-细胞胚胎解冻后的存活率分别为92.5%和93.33%;ICR代小鼠8-细胞胚胎解冻后的存活率分别为65.83%和67.50%。同一品系体外受精与体内受精来源的8-细胞胚胎冷冻复苏后胚胎存活率差异不显著(P>0.05),但不同品系体外受精及体内受精来源的8-细胞胚胎复苏率差异均显著(P<0.05),表明8-细胞胚胎冷冻复苏率的高低与胚胎获得的方法无关,但与品系的不同有关。     

影响奶牛体外受精胚胎培养效果的胚胎因素

对胚胎因素影响奶牛体外受精胚胎培养效果进行了研究。结果发现,在胚胎因素中,胚胎类型(冻胚和鲜胚)与胚胎发育阶段对胚胎培养效果没有显著影响(P>0.05);冷冻胚胎解冻后停留时间对胚胎培养效果影响极显著(P<0.01);冷冻胚胎解冻后胚胎等级对胚胎培养效果影响显著(P<0.05),解冻后A级胚胎存活率(80%,128/160)、囊胚孵化率(58.75%,94/160)显著高于B级胚胎存活率(59.38%,95/160)和囊胚孵化率(37.5%,60/160)(P<0.05);解冻水浴温度(20℃、30℃)对培养效果有极显著影响(P<0.01)。     

牛胚胎冷冻技术的实用化研究

采用不同的冷冻程序，不同的植冰温度，不同的冷冻保护剂，不同的解冻液及不同的解冻方式对牛胚胎冷冻及解冻技术的各个环节进行研究，目的是选择简便，高效的牛胚胎冷冻方法，综合冷冻过程，减少冷冻，解冻中对胚胎的损伤，提高胚胎解冻成活率和移植妊娠率。     

家兔胚胎的快速冷冻与解冻

将2～3日龄的兔胚,在1.5M—DMSO的PB1溶液中,用快速法冷冻。胚胎在液氮(-196℃)内保存23～106天。快速解冻后,经鉴定216个胚胎中,形态正常的有129个(占59.7％)。把102个胚胎移植给9头受体兔,有7只妊娠,生出27只小兔。受体妊娠率为77.7％,产仔率为26.4％。还在体外培养了73个胚胎,1～2天后,有32个(43.8％)发育到囊胚期。将26个解冻后培养到囊胚期的胚胎移植给2只受体,有1只生出6只小兔。试验表明,快速冷冻的胚胎在液氮中保存106天,快速解冻后仍有活力,而且桑椹期的胚胎比8～16细胞期胚胎更抗冻。     

牛胚胎冷冻技术的研究

本文采用不同的冷冻程序，不同的植冰温度，不同的冷冻保护剂，不同的解冻液及不同的解冻方式对牛胚胎 冷冻及解冻技术的各个环节进行了研究，目的是选择简便，高效的牛胚胎 冷冻方法，缩短冷冻过程，减少岭冻，解冻中对胚胎的损伤，提高胚胎解冻成活率和移植妊娠率。     

小鼠胚胎快速冷冻的研究

本文研究了小鼠胚胎快速冷冻方法,以ＰＢＳ＋２．０Ｍ甘油＋０．５Ｍ蔗糖为冷冻液,以ＰＢＳ＋０．５Ｍ蔗糖为称释液。结果桑椹胚冷冻解冻后的存活率为６９．３％,早期囊胚冷冻解冻后的存活率为６０．４％,二者之间无显著差异。     

不同稀释液配方对奶牛冷冻精液的影响

采用假阴道法采集成年种公牛精液,经精液品质检查后,合格精液用四种不同冷冻稀释液进行稀释、冷冻、以筛选出适宜的冷冻稀释液和最佳冷冻保护剂.结果表明:Ⅱ号稀释液优于其它3种稀释液(P＜0.05);甘油为最佳冷冻保护剂.优于乙二醇和DMSO冷冻效果(P＜0.05),其最佳浓度为7%,精子冷冻后活率平均可达0.45±0.575,畸形率15.44%,项体完整率57.82%;奶牛细管冻精的解冻效果以75℃水浴,2 S到6 S的解冻时间最佳.     

不同解冻程序对荣昌猪冷冻精液解冻效果的影响

为优化猪冷冻精液解冻程序,本研究使用3种解冻液(M、J和C)对荣昌猪冷冻精液进行解冻,检测冷冻精液在不同解冻温度(32、37、42、47、52℃)和不同解冻时间(10 s或20 s)解冻后的精子活率、精子活力、快速前进运动精子数和慢速前进运动精子数,并使用因子分析法评估不同解冻液最佳解冻程序。结果显示:解冻液M在保存指标和持续指标方面较优;解冻液J在即时指标和持续指标方面较优;解冻液C在持续指标方面较优。综合分析表明,解冻液M和解冻液J的最佳解冻程序为42℃水浴解冻20 s,解冻液C的最佳解冻程序为32℃水浴解冻20 s。