农杆菌介导玉米遗传转化体系的研究

为了提高玉米自交系的遗传转化率,建立农杆菌介导玉米遗传转化体系。通过农杆菌菌株EHA105侵染玉米自交系7922的胚性愈伤组织,以β-葡萄糖苷酶基因(GUS)为报告基因研究几种因素对遗传转化体系的影响。结果表明：（1）当农杆菌浓度OD600=0.6时,GUS瞬时表达率最高为35.3%;（2）当侵染时间为15 min时,GUS瞬时表达率最高为37.3%;（3）当共培养时间为3天和恢复培养时间为4天时,GUS瞬时表达率最高为29.1%。因此选择农杆菌浓度OD600=0.6,侵染时间15 min,共培养3天和恢复培养4天,为最佳遗传转化条件。通过优化影响遗传转化体系的因素,初步建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。     

适用于4种玉米基因型的农杆菌转化方法的探讨

利用改良的农杆菌培养液、侵染液、共培养培养基和筛选培养基等技术体系,对4个玉米基因型Hi-Ⅱ、H99、国内2个优良自交系R18-599和齐319的新鲜幼胚、预培养幼胚、胚性愈伤组织进行了农杆菌转化研究,并比较了不同共培养方式对农杆菌侵染不同玉米组织的影响。结果表明,Hi-Ⅱ新鲜幼胚在固体培养基上共培养和滤纸上共培养后GUS基因瞬间表达率分别为83.7%和4.4%,前法优于后法;Hi-Ⅱ新鲜幼胚、预培养3 d的幼胚愈伤组织经农杆菌侵染后GUS基因瞬间表达率分别为83.7%和12.1%,新鲜幼胚比预培养的幼胚愈伤组织更适合于农杆菌转化。用上述优化的条件对另外3个不同基因型的2种不同外植体H99、齐319(新鲜幼胚)和R18-599（胚性愈伤组织）进行遗传转化,共培养3 d后的GUS基因瞬间表达率分别为65.2%、52.6%和58%,表明该转化体系适合于上述4种基因型的幼胚和胚性愈伤组织的遗传转化。此外农杆菌侵染Hi-Ⅱ新鲜幼胚后经在含巴龙霉素25~100 mg L^-1培养基上3轮选择后,抗性愈伤组织获得率为2.4%,近似反映了本研究的遗传转化率。其他3个基因型的抗性愈伤也正在筛选中。结果初步表明,本研究建立的农杆菌介导的玉米遗传转化体系可能对4种基因型均适用。     

农杆菌介导谷子成熟胚遗传转化体系的建立与优化

为建立一个稳定的谷子遗传转化体系,对216份谷子种质资源进行筛选,确定材料178成熟胚为受体材料,从植物激素浓度、防褐化剂、农杆菌菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮（AS）浓度等方面对谷子再生及转化体系进行优化。结果表明,在MS培养基中加入生长素2,4-D 9μmol/L、细胞分裂素Kinetin 4μmol/L、硝酸银8mg/L,愈伤组织诱导率最高且能有效防止褐化。在侵染液和共培养基中加入100μmol/L AS,gus表达效果最好。农杆菌溶液OD₆₀₀为0.3~0.5,侵染15min,共培养3d时,抗性愈伤组织率最高。获得的转基因植株,经PCR检测及gus染色分析,确定外源bar基因已成功整合到谷子基因组中。初步建立了一套谷子遗传转化体系,为今后谷子遗传转化提供一些参考。     

农杆菌敏感小麦基因型筛选与转化条件的优化

以13个基因型小麦的幼胚愈伤和新春9号幼胚为受体材料,利用农杆菌菌株C58C1(含有GUS外源基因)进行侵染,通过组织化学染色的方法统计GUS基因瞬时表达率,以筛选对农杆菌敏感的小麦基因型及适宜的菌液浓度和侵染时间,优化农杆菌转化的条件,为逐步建立小麦农杆菌的转化体系奠定基础.结果显示,不同基因型小麦GUS瞬时表达率在0～95.9％之间,其中新春9号、小偃328和济麦19的GUS基因瞬时表达率均在90％以上;对新鲜幼胚和预培养7d的幼胚愈伤组织分别侵染30 min和60 min,前者GUS阳性率均为0,后者分别为92.0％和95.9％,说明预培养可以显著提高受体材料对农杆菌的敏感性,提高转化效率;在不同菌液浓度(OD600=0.5、1.0、1.5)侵染时,GUS基因瞬时表达率分别为93.4％、94.0％和87.6％,不同侵染时间(15,30,60 min)下,GUS基因瞬时表达率分别为94.6％、92.0％和95.9％.综合考虑认为,适宜的小麦农杆菌转化条件为幼胚经过4～7 d预培养,在菌液浓度OD600=1.0时进行15 min的侵染.     

正交设计优化根癌农杆菌介导的玉米遗传转化体系

采用GUS基因瞬时表达检测的方法,利用正交试验法对玉米根癌农杆菌介导的玉米遗传转化体系的菌液OD值、侵染时间、AS浓度、共培养时间4个因素在3个水平上进行优化试验。通过对试验结果进行直观分析,方差分析和因素内多重比较分析,得到了稳定的转化体系,即菌液OD值0.6,侵染时间30min,AS浓度200μmol/L,共培养时间2d。采用优化后的玉米转化体系进行试验,通过PCR验证,得到了转基因植株,初步建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。     

小豆子叶节遗传转化体系建立

以小豆品种‘京农6号’子叶节为外植体进行离体再生,旨在建立‘京农6号’子叶节再生遗传转化体系。本研究对农杆菌菌株EHA105侵染子叶节的时间、诱导愈伤生成的适宜6-BA浓度、诱导不定芽的激素浓度及配比及诱导不定根生长的IBA浓度等影响子叶节再生遗传转化体系的因素,结果发现农杆菌EHA105侵染的最佳时间为50 min,GUS阳性率为67.5%;诱导愈伤的适宜6-BA浓度为2.0 mg/L,诱导率为91.4%;诱导不定芽的最适激素是5.0 mg/L ZT,出芽率为62.0%;而0.1 mg/L IBA诱导不定根的效果最好,生根率可达100.0%。本研究建立了小豆‘京农6号’子叶节外植体的遗传转化体系,获得了再生植株,为小豆的CRISPR/Cas9基因编辑技术在小豆功能基因组学和育种中的应用提供了技术参考。     

根癌农杆菌介导的巴西橡胶树胚性悬浮细胞的遗传转化

为了建立橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化体系,用根癌农杆菌EHA105（携带pCAMBIA1301,含有gusA和hpt Ⅱ）侵染胚性悬浮细胞团,用GUS检测的方法分析了共培养时间和菌液浓度对转化效率的影响;同时,测定了胚性细胞团对潮霉素敏感性。结果表明适宜的共培养时间为3天,适宜的菌液浓度为OD600=0.4~0.6。潮霉素的致死剂量为15 mg/L。使用大约1 g鲜重的胚性细胞团,经过转化和选择培养,获得53块抗性愈伤组织,经诱导获得7个体细胞胚。GUS检测和PCR鉴定证实了gusA基因已经整合到橡胶树基因组中。本研究为根癌农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化体系建立奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的磨盘柿遗传转化体系的优化

以磨盘柿叶片为外植体,通过农杆菌介导法,建立了ACC合成酶基因(ACS)遗传转化体系。研究了预培养时间、农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间和乙酰丁香酮(AS)浓度等因素对基因转化的影响。结果表明:适宜的预培养时间为2 d;用OD600值为1.0的菌液侵染15 min、共培养3 d,AS浓度200μmol/L有利于提高转化频率。经PCR分子检测,初步确定ACC合成酶基因已转入磨盘柿组培苗中。     

中国水仙NtFT2正义基因表达载体的构建与愈伤组织遗传转化体系的建立

构建中国水仙Nt FT2正义基因表达载体,为进一步研究Nt FT2基因对中国水仙芽休眠调控作用提供参考;建立中国水仙愈伤组织遗传转化体系,为中国水仙愈伤组织遗传转化提供技术平台。笔者以中国水仙主芽为材料,通过PCR扩增获得Nt FT2基因;通过PCR、双酶切、连接等方法将Nt FT2基因正向插入到p CAMBIA1301双GUS植物表达载体构建Nt FT2正义基因表达载体P1301-FT2,再通过冻融法将重组质粒P1301-FT2导入根癌农杆菌。采用根癌农杆菌介导法将Nt FT2正义基因转化中国水仙愈伤组织,采用GUS组织化学染色法检测中国水仙愈伤组织遗传转化效率。结果表明,试验成功构建了中国水仙Nt FT2正义基因表达载体P1301-Nt FT2;中国水仙愈伤组织与0.5 mol/L甘露醇共培养6 h后,置于1.0 OD600的农杆菌重悬液中侵染20 min,在25℃、黑暗条件下,共培养6天,其GUS瞬时表达率达到64.28%。构建了中国水仙Nt FT2正义基因表达载体,建立了高效的中国水仙愈伤组织遗传转化体系。     

农杆菌介导的烟草瞬时表达试验条件优化

以整株烟草为试材,用转入植物表达载体p CAMBIA1301的根癌农杆菌EHA105进行遗传转化。通过分析不同菌液浓度、乙酰丁香酮浓度、Tween20浓度、蔗糖浓度、不同侵染时间及有无激素对GUS基因表达的影响,研究其瞬时表达的最佳条件。结果显示:用OD600值为0.2的农杆菌侵染3 h,在1/2 MS培养基中添加120μmol/L的乙酰丁香酮,1.5 mg/L的KT,0.5 mg/L的NAA,3%的蔗糖,共培养3 d,能够得到高效的GUS基因瞬时表达。     

基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌介导转化方法的研究

以中棉所49、珂字棉201和YZ-1为受体材料,通过对培养基草甘膦浓度、农杆菌侵染时间和浓度、共培养时间以及恢复培养条件等因素的优化,建立了基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌转化技术体系,并将抗草甘膦基因(EPSPS-G6)导入3个受体材料,获得转基因抗草甘膦棉花植株.研究结果表明,适合于棉花茎尖农杆菌介导的草甘膦筛选浓度为10 mg·L-1;茎尖转化体系为农杆菌菌液OD600为0.9～1.0,侵染时间为20min,共培养时间为48 h,选用SH培养基并加入适量活性炭(0.5 g·L-1)作为恢复培养基.用本研究创制的转化技术体系,转化处理3个陆地棉受体360个茎尖,共获得60株抗性再生植株,经PCR检测,获得阳性抗性植株26株,移栽成活23株.以茎尖外植体数计算,本体系的转化成功率6.4％.该转化体系适合于转化抗草甘膦基因或以抗草甘膦基因为筛选基因的外源基因,具有转化频率高、嵌合体少、转化周期短等优点.     

根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传转化体系的建立

为建立根癌农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系,以花药愈伤组织为受体,研究了农杆菌菌株、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等因素对遗传转化效率的影响。结果表明,农杆菌菌株、共培养温度和共培养时间对转化效率具有显著影响,AS不影响转化效率。2.2万个花药愈伤组织经EHA105菌株侵染后,转入未添加AS的培养基,22℃共培养6d,通过50mgL-1卡那霉素抗性筛选、叶片GUS染色、uidA和NptII基因PCR特异扩增、PCR产物测序及NptII基因Southern检测,鉴定出11株转基因植株,并通过嫁接和次生体胚发生,获得来自8个转基因株系的681株转基因植株,移栽成活253株。     

多基因表达载体KCTB转化宁夏枸杞的研究

为研究多基因表达载体KCTB转化宁夏枸杞,本研究利用农杆菌介导技术,利用叶盘转化法,将构建有GUS、BAR、KC1、CAF14个功能基因的表达载体KCTB转化宁夏枸杞,并获得了23株抗性植株;GUS组织化学染色显示,在转基因植株的根、茎、叶中都有表达,PCR结果显示,分别检测到了BAR、KC1、CAF1基因,说明多基因表达载体KCTB已经完全整合到了宁夏枸杞的基因组中。     

超声波辅助农杆菌介导SeNHX1基因转化紫花苜蓿的研究

为建立高效快速的紫花苜蓿遗传转化体系,以紫花苜蓿6个栽培品种为材料,采用超声波辅助农杆菌介导法,对影响紫花苜蓿遗传转化体系的若干因素进行了研究。结果显示,6个栽培品种对卡那霉素敏感性不同,维多利亚为40 mg/L,而其他5个品种为50 mg/L;通过梯度实验表明：根癌农杆菌侵染浓度OD600为0.4~0.5,侵染时间为10~15 min,超声波处理时间为10 min是实现紫花苜蓿子叶转化及抗性愈伤组织形成较为有利的组合。卡那霉素抗性愈伤组织DNA的PCR扩增显示,转化体和质粒DNA分别扩增出长度大约为546 bp的清晰条带,初步表明耐盐SeNHX1基因已整合至紫花苜蓿愈伤组织中。     

高粱幼叶细胞悬浮系的建立

以高粱无菌苗幼叶为试验材料,对颗粒状胚性愈伤组织的获得、细胞悬浮系的建立及影响悬浮细胞生长的主要因素进行了研究。结果表明：幼叶在MS（Murashige and Skoog）+2mg/L 2,4-D培养基上诱导出的愈伤组织,经2~3次继代筛选后获得了浅黄色、颗粒状胚性愈伤组织;胚性愈伤组织接种于液体培养基中,于25±1℃、黑暗条件下,经45~60d的悬浮震荡培养建立了高质量的细胞悬浮系,细胞生长曲线呈“S”型,细胞密度可达6.45×10 ⁵~5.08×10 ⁶个/mL以上,活细胞率可达72.76%,近圆细胞率可达87.50%;培养基的基本成分、激素种类和水平对悬浮细胞生长状态有很大的影响,相比1/2MS培养基,MS培养基为适宜的培养基,2,4-D对保持细胞系的稳定增殖至关重要,适宜的浓度为1mg/L;培养液中加入0.5mg/L KT或6-BA会造成悬浮液褐化,影响悬浮细胞的生长;最适宜的细胞悬浮培养基为L2培养基（MS+1mg/L 2,4-D,30g/L蔗糖,pH5.8）,震荡培养转速为110~120r/min,继代周期为7d,新旧培养基的接种比例为2∶1。     

防除甜高粱田杂草的除草剂筛选

大田甜高粱种植过程中往往杂草普遍发生,严重影响经济效益,且国内外关于甜高粱田化学除草的研究报道也很少。以苏科甜1号为材料,选用二甲戊灵、莠去津、精-异丙甲草胺、二氯喹啉酸、乙草胺、使它隆、二氯喹啉草酮的单剂或者混剂,采用甜高粱播后苗前、苗后除草剂处理方式,以期筛选出对甜高粱安全且对杂草具有高效防除的除草剂。结果显示：在甜高粱播后苗前用33%二甲戊灵2 250mL/hm ²+38%莠去津2 250mL/hm ²防除杂草效果最好,总杂草株防效达99.7%,对甜高粱没有药害;在甜高粱出苗后4~5叶期,用20%二氯喹啉草酮2 000mL/hm ²+38%莠去津5 000mL/hm ²防除杂草效果最优,总杂草株防效与鲜重防效分别为99.2%、99.5%,对甜高粱也没有药害。以上2种药剂处理可作为甜高粱田杂草防除的理想选择。     

拟青山海关杨高效遗传转化系统的建立

本实验以叶片为外植体,建立了拟青山海关杨的高频再生系统;在此基础上,利用GUS瞬时表达法研究了菌种、预培养时间、侵染菌液浓度、侵染时间和乙酰丁香酮（AS）浓度5个因素对拟青山海关杨叶片遗传转化的影响。结果表明,拟青山海关杨叶片最适不定芽诱导培养基为MS添加0.5mg/L的6-BA 和0.1mg/L的NAA,叶片再生频率为95%,平均不定芽数为10.07个;该杨树的高效遗传转化体系为：叶片省去预培养,菌种使用GV3101,侵染液OD600为 0.4～0.6,侵染10min,共培养培养基中添加乙酰丁香酮 200μmol/L,在此条件下,GUS荧光定量分析结果显示叶片的GUS活性达到最大值。     

外源硒对高粱产量、籽粒硒含量及品质的影响

在高粱关键生育期叶面喷施不同剂量Na₂SeO₃,研究外源硒对高粱产量、品质及籽粒硒含量的影响,明确施用外源硒的最佳剂量和最适宜时期,同时为研究硒对高粱生理方面的影响及富硒高粱的生产提供理论依据。以糯高粱品种晋糯3号为材料,采用随机区组试验,设置0（CK）、40（T1）、80（T2）、120（T3）和160mg/kg Na₂SeO₃（T4）5个供硒水平,分别在苗期、拔节期和挑旗期进行叶面外源硒喷施,研究不同时期、不同剂量供硒条件下高粱产量、品质及籽粒硒含量的变化规律。结果表明,施用外源硒一定程度上可以提高高粱籽粒硒含量,不同时期喷施外源硒对高粱籽粒硒含量的影响为挑旗期>拔节期>苗期。在人体吸收硒的安全摄入范围内,挑旗期T2施硒剂量下,晋糯3号籽粒硒含量2年平均为0.295mg/kg,比CK平均提高83.5%。叶面喷施硒对提高高粱籽粒粗蛋白和粗淀粉含量有促进作用,喷施时期对高粱品质的影响为挑旗期>拔节期>苗期>CK。挑旗期T2处理的籽粒粗蛋白和粗淀粉含量最高,分别比CK提高11.25%和1.40%。叶面喷施合适剂量的Na₂SeO₃能够明显提高高粱籽粒硒含量,改善高粱籽粒营养品质,对高粱增产有一定促进作用。综合所述,挑旗期是高粱富硒的最佳喷施时期,最适宜的叶面施硒（Na₂SeO₃）剂量为80mg/kg。