弯孢类炭疽菌rDNA ITS区的RFLP分析及分类研究

 应用核糖体DNA ITS区的RFLP分析对3 8个不同寄主来源的弯孢类炭疽菌菌株的遗传多样性和系统发育进行研究。结果表明:弯孢类炭疽菌的ITS扩增区(ITS₄~ITS₅)约为650 bp,无长度变异。5种内切酶(Alu I、Bsu RI、Hin 6 I、Hpa Ⅱ和Taq I)的酶切图谱在种内是相似或一致的,而种间差异较大。ITS-RFLP共迁带UPGMA聚类分析的结果表明:3 8个弯孢类炭疽菌菌株被聚为6个类群,群与群之间分界明显,表明种的分界相当明显。ITS-RFLP分析的结果还揭示了一些近似种的分类关系,如,按传统方法分别鉴定为Colletotrichum truncatum、C.circinans和C.capsici的许多菌株有相似或完全一致的内切酶酶切图谱,这些分子特征支持它们为同一个种。     

北京地区芹菜细菌性软腐病菌鉴定及其致病力分析

 对从北京地区芹菜软腐组织中分离到的37株细菌性软腐病菌株,进行了微生物碳源利用(Biolog^TM)、生化特性、特异性PCR、ITS-RFLP带型以及基于16S rDNA完整序列遗传关系分析。结果如下:菌株革兰氏染色阴性、具周生鞭毛;可在5%和7% NaCl及28℃和37℃条件下生长;可分解柠檬酸盐及液化明胶;Biolog分析将这些菌株均鉴定为Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc)。生化特性分析发现,其中36株菌株能利用D-山梨醇、D-阿拉伯糖醇、异麦芽酮糖和α-甲基葡萄糖苷,与对照菌株P. carotovorum subsp. odoriferum(Pco)S7一致;另外1株菌株Q34不能利用上述糖醇,与对照菌株P. carotovorum subsp. brasilience (Pcb)BC1和P. carotovorum subsp. carotovorum(Pcc)ECC71表现一致。利用pel(pectate lyase)基因特异性引物Y1/Y2在所有的37株菌株中均扩增出预期片段(434 bp),表明其基因组中均含有果胶酶基因。Pcb特异性PCR引物BR1f/L1r仅在Q34菌株与Pcb BC1中扩增出预期片段(322 bp),而Pcc特异性PCR引物EXPCCF/EXPCCR则在除Pcb BC1外所有菌株中均扩增出预期片段(550 bp)。Rsa I酶切16S-23S rDNA ITS片段结果显示,Q34酶切带型与Pcb BC1相同,其余36株带型与Pcc ECC71和Pco S7相同。基于16S rDNA基因完整序列,以Dickeya dadantii菌株582为外群,该37株菌株与已发表的Pectobacterium菌株系统发育树聚类分析结果表明,Q34与已发表的其他Pcb菌株形成了明显的Pcb类群,其余36株菌株则与已发表的其他Pco菌株形成了明显的Pco类群。综合多种鉴定结果,36株被鉴定为Pco,Q34被鉴定为Pcb。菌株致病力测试结果显示,36株Pco菌株中仅Q47表现为低等的致病力,其余24株和11株分别表现为中等和高等致病力;Pcb菌株Q34则表现出中等致病力。     

河南省小麦黑胚病优势病原菌链格孢菌(Alternaria spp.)遗传多样性分析

 采用RAPD技术对分离自河南省各地的43株小麦黑胚病优势病原菌(Alternaria spp.)菌株进行了遗传多样性分析。17个随机引物共扩增出151条清晰的DNA条带,所扩增出的DNA条带均为多态带,说明河南省小麦黑胚病菌存在着丰富的遗传多样性。利用NTSYS软件进行了病原菌的聚类分析,结果表明,河南省小麦黑胚病菌主要有2个种,即Alternaria alternata和A. tenuissima,种间的遗传相似系数的变化幅度为0.62~0.92。来自同一个地区的小麦黑胚病菌菌株基本上聚在了一起,表现出很近的亲缘关系,来自不同地区之间的菌株也可以交叉聚类。病原菌遗传多样性分析进一步验证了形态学的鉴定结果。     

辣椒炭疽病菌对嘧菌酯的敏感性测定

 从江苏和海南省随机采集分离获得45个辣椒炭疽病菌单孢菌株,根据孢子形态鉴定其病原菌为Colletotrichum gloeosporioides和C.capsici,其中C.gloeosporioides占总菌株数的64.4%.筛选出甘油琼脂(AEA)培养基和水琼脂(WA)培养基,分别作为产孢法和孢子萌发法测定辣椒炭疽病菌对嘧菌酯敏感性的适宜培养基.通过孢子萌发法测定2种病原菌45个菌株对嘧菌酯的敏感性范围在0.009~0.091μg/mL之间,平均EC₅₀为(0.047±0.040)μg/mL.其中29个C.gloeosporioides菌株和16个C.capsici菌株的平均EC₅₀值分别为(0.051±0.047)μg/mL和(0.041±0.024)μg/mL.研究发现旁路氧化酶抑制剂水杨肟酸(SHAM)对嘧菌酯抑制分生孢子萌发有协同增效作用,且嘧菌酯抑制辣椒炭疽病菌菌丝生长的能力较弱.     

十字花科蔬菜黑斑病菌的PCR鉴定

 在对十字花科蔬菜黑斑病菌(Alternaria sp.)3个种及相近种的5.8SrDNA和其侧翼ITS区进行测序的基础上,分别设计合成了鉴定白菜黑斑病菌3个种的特异性引物。PCR扩增结果表明:Abre1和Abre2引物对能特异性扩增芸苔链格孢(A.brassicae)371bp的片段,Abra1和Abra2引物对能特异性扩增甘蓝链格孢(A.brassicicola)457bp的片段,Ajap1和Ajap2引物对能特异性扩增萝卜链格孢(A.japonica)411bp的片段,而且其它近源种未扩增出目标片段,说明这3个引物对可以作为十字花科蔬菜黑斑病菌3个种快速检测鉴定的分子特征标记。     

新月弯孢菌营养体亲和群鉴定方法探讨

 采用菌株直接配对、显微镜观察菌丝融合和硝酸盐缺陷型(nit)突变体互补测试法,对44个来自不同地区的玉米弯孢菌叶斑病叶中的新月弯孢菌(Curvularia lunata)菌株进行了营养体亲和性分析。在野生型菌株的两两配对中,C.lunata菌株接触产生4种反应类型,但无明显的抗衡反应产生。在菌丝融合显微观察中,光学显微镜下只见大多数菌丝反应为一菌丝向另一菌丝无限靠近,未见融合,但在电子显微镜下,发现两菌丝细胞已不再是独立的。这些结果表明,因两菌落间的抗衡反应和菌丝融合特征都不明显,故不宜采用直接配对和显微观察来划分C.lunata的营养体亲和群。在nit突变体互补测试中,菌株在KClO₃浓度1.5%~3.0%的KPS中诱导表明,2.0%~3.0% KClO₃适宜于大多数菌株。抗氯酸盐突变体在Czapek培养基中能鉴定出nit突变体,但在MM上却不能。全部3640抗氯酸盐突变体在Czapek中共鉴定出2 40个稳定的nit突变体,其中nit1占59.2%,nit3占39.2%,NitM占0.8%,nit D (3种氮源都不能利用)占0.8%。44个菌株中,24个(55%)获得了nit突变体,20个(45%)还没有,仅2个菌株(124和155)各获得了1个NitM突变体。各菌株突变体类型间只有NitM与nit1或nit3是异核亲和的,其余均不能产生亲和反应。菌株124和155都是营养体自身亲和菌株。用2个NitM作测试菌株,初步划分出2个VCGs,5个归入VCG1,另有5个归入VCG2,其它菌株因未获得NitM或nit突变体还不能鉴定。以上结果表明,硝酸盐缺陷型突变体互补测试法可用于鉴定C.lunata菌株的营养体亲和群。     

烟草低头黑病病原菌的研究

 烟草低头黑病是烟草的主要病害之一,主要发生于山东潍坊一带烟区。经过对病原菌分离培养、形态特征观察、致病性和寄主范围测定,鉴定为辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)的新变型——辣椒炭疽菌烟草变型(Colletotrichum capsici (Syd.) Butler & Bisby f. nicotianae G. M. Zhang & G. Z. Jiang f. nov)(烟草低头黑病菌)。     

番茄叶霉病高抗基因Cf-9、Cf-11和Cf-19的分子标记

 本研究以9个含不同叶霉病抗病基因的番茄品种为试材,通过接种鉴定表明,Cf-5、Cf-9、Cf-11和Cf-19基因对我国目前的2个叶霉菌优势生理小种均具有较强的抗性。根据Cf-9基因设计引物,扩增Cf-9基因的片段,含Cf-9、Cf-11和Cf-19基因的3种番茄均获得了2.7kb的扩增片段。但用限制性内切酶TaqⅠ对PCR产物酶切可以将3种材料明显区分开来,Cf-9的2个差异酶切片段为1170和460bp;Cf-11的2个差异酶切片段为1100和410bp;Cf-19的2个差异酶切片段为1210和300bp,从而建立了3个基因的分子标记。在F₂分离群体中验证表明,3个基因的分子标记鉴定结果与抗性接种鉴定结果是一致的,用这些标记可以进行分子标记辅助选择。     

香蕉炭疽菌rDNA ITS区的分子鉴定与检测

 香蕉炭疽病菌(Colletordchum muscat)是一种引起香蕉采后病害的最重要病原,本研究用真菌18S~28S间的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)通用引物18SF和28SR扩增香蕉炭疽菌和其它外群真菌的基因组DNA,扩增出约510bp的片段;通过克隆测序香蕉炭疽菌的ITS全序列并与GenBank中炭疽菌属其它种的ITS序列比对,设计出香蕉炭疽菌的特异性引物ColM1和ColM2。用此特异引物可以从香蕉炭疽菌株中扩增出382bp的特异性片段,而其余20个参试菌株和香蕉组织的PCR反应结果为阴性,灵敏度实验证明可以检测到目标DNA的浓度为0.1Pg。该方法可用于快速、准确和灵敏地检测香蕉炭疽菌,为快速监测组织中有无香蕉炭疽病菌潜伏侵染与及早采取防治措施提供积极的指导意义。     

一个与稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik~m连锁的SCAR标记的分离

 本研究将以前在稻瘟病菌菌株S1522获得的与决定对水稻品种梅雨明无毒性的基因(AVR-Pik^m)相连锁的1个RAPD标记OPO12₁₀₀₀进行了克隆和鉴定。核苷酸序列测定与分析结果表明:OPO12₁₀₀₀的大小为946个碱基,不含有与已报道的稻瘟病菌Mg-SINE、Fosburry、Magyy、Grasshopper、Pot2以及Pot3等同源的重复序列。根据OPO12₁₀₀₀的核苷酸序列,设计了1对24个核苷酸的特异引物,对无毒表型亲本S1522和毒性表型亲本S159、无毒表型群体基因池、毒性表型基因池以及有性杂交后代108个菌株进行了PCR扩增,所有无毒表型的菌株均能特异性地扩增出1条与OPO12₁₀₀₀大小相同的DNA条带,而毒性表型的菌株除5个重组个体外,均不能扩增出这条特异带。此结果表明,与稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik^m连锁的RAPD标记OPO12₁₀₀₀被成功地转化为SCAR标记,为进一步通过染色体步移克隆该无毒基因奠定了基础。     

几种中草药抽提物对黄瓜花叶病毒引起的辣椒花叶病治疗作用初步研究

 在完整植株上,利用喷叶法测定中草药抽提物,以及少量微生物代谢产物,对黄瓜花叶病毒引起的辣椒花叶病的治疗效果。以处理组病指与对照组病指减少百分率表示疗效,用ELISA检测植株体内病毒浓度。根据提纯病毒浓度(X)和吸光值(Y)之间的回归关系,得标准方程:Y=0.437lgx-0.28,相关系数r=0.97。从112个材料中发现,连翘(Forsythia suspensaVahl)大黄(Rheum officinalle Bail)和板兰根(Isatis tinctoria L.)具有比较稳定的疗效。在接种前72小时和接种后24小时喷施抽提物,三者疗效均在90%以上。接种24小时后喷施大黄板兰根疗效均在70%以上。在大黄板兰根治愈的植株内检测不出病毒,在显症植株内,病毒浓度分别下降60%和70%。大黄在接种72小时后喷施.或稀释100倍时仍具显著疗效,并引起植株体内过氧化物酶谱显著变化。大黄对植株生长具一定的促进作用,而板兰根引起植株黄化,侧芽提早萌发。     

黄瓜花叶病毒在中国的新寄主——百日草

正百日草(Zinnia elegans Jacq.)属菊科,为一年生草本,于20世纪20年代从美国和日本引种我国。其因花期长、颜色艳丽等优良园艺特性而成为园林绿化常用花卉。自然条件下,多种病原可侵染百日草,导致其观赏价值下降。近年在陕西杨凌发现百日草表现典型的花叶症状,查阅文献发现该花叶病可能与病毒侵染有关。例如,1975年以色列报道,黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)金盏菊分离物通过摩擦接种能够侵染百日     

陕西省小麦禾谷镰刀菌的遗传多样性研究

为了明确陕西省小麦禾谷镰刀菌混合群(Fusarium graminearum species complex)的遗传多样性,利用4对E coRⅠ和M seⅠ引物对来自陕西省19个区县的162株小麦禾谷镰刀菌菌株进行了AFLP扩增。结果表明,4对引物均能扩增出数量不等的多态性条带,最少的6条,最多的20条,大部分扩增片段在100～750bp之间。利用NTSYS-2.1软件聚类分析表明,不同地区禾谷镰刀菌可分为两大类群,即类群A和类群B。这两大类群的分化和地理来源有明确相关性,类群A主要分布在关中地区,类群B主要分布在陕南地区。初步判断可能与两个地区生态环境和小麦主栽品种差异有关。各类群内的菌系与地理位置间的关系较为复杂,一些菌系与地理来源存在明确关系,而个别菌系与地理来源间的关系尚不能完全明确。还需进一步研究以明确各菌株与地理来源之间的关系。     

玉米根际细菌群落特征及生防菌筛选

为了明确玉米根际细菌群落结构特征并从中筛选玉米病害生防资源,本研究采用培养法从玉米根际分离得到1584株细菌,分别属于变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门,其中变形菌门为优势菌群。在属水平上,假单胞菌为优势菌群。以玉米大斑菌为靶标菌,通过平板对峙方法,筛选出162株具有抑菌效果的菌株,其中1株抑菌效果最强,根据形态学和分子生物学结合的方法,将其鉴定为解淀粉芽胞杆菌。该菌对4种玉米病害病原菌具有广谱的抑菌效果,且含有脂肽类抗生素合成基因,其脂肽类物质粗提液对病原菌的抑制率高达81.56%。总体来看,该菌株具有较大的生防潜力,可作为生防菌防治玉米病害。     

玉米BTB家族基因的鉴定与表达规律分析

本研究利用生物信息学方法对玉米BTB家族基因进行系统发育、保守结构域、组织特异性以及在玉米抵抗生物和非生物胁迫过程中的表达规律进行分析.发现玉米70个BTB家族蛋白除AC206223.3外均含有保守的BTB结构域,可分为11个亚家族.玉米BTB家族基因具有明显的组织表达特性,在高温、低温、紫外、高盐和干旱胁迫下以及拟轮...     

福建青枯雷尔氏菌的遗传多样性及其生防放线菌的筛选

为了明确福建青枯雷尔氏菌（简称青枯菌）的遗传多样性,综合菌株的演化型、生化型及基于内源葡聚糖酶基因egl的序列变种鉴定,对福建省8个地区的番茄、辣椒和茄子寄主分离的56株青枯菌进行分析。结果表明：供试的56株青枯菌均属于演化型Ⅰ;53株为生化型Ⅲ（占94.64%）,1株为生化型Ⅱ,2株为非标准生化型;从序列变种来看,4株来自茄子的青枯菌均属序列变种15,24株来自辣椒的青枯菌中,23株属于序列变种14,1株为序列变种16,28株番茄青枯菌鉴定出7个序列变种。进一步,选择上述鉴定的生化型Ⅲ和生化型Ⅱ的代表菌株为靶标菌进行生防菌筛选。结果表明,供试14株放线菌中,筛选到1株对生化Ⅲ青枯菌有拮抗作用的放线菌FJAT-31535。基于菌落形态特征和16S rRNA基因序列相似性分析,菌株FJAT-31535属于链霉菌属（Streptomyces sp.）。     

芽胞杆菌SM905的鉴定及其对铁皮石斛胶孢炭疽菌的抑菌活性研究

芽胞杆菌Bacillus sp.SM905是本实验室分离并保存的一株活性细菌，为进一步明确其分类地位及其对铁皮石斛胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的抑菌活性，利用形态学、生理生化特性及16S rDNA和gyrB序列分析对SM905进行种属鉴定；采用菌丝生长速率法、插片法和琼脂平板法测定了不同浓度的SM905发酵上清液对靶标菌菌丝生长和孢子萌发的影响；并通过盆栽试验考察其防效。结果表明，SM905为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。不同稀释倍数的SM905发酵上清液对胶孢炭疽菌均有一定的抑制作用，其中5倍稀释液对菌丝生长的抑制率最高，为97.89%，20倍稀释液的抑制率也达90%左右。处理组残留胶孢炭疽菌气生菌丝表现为畸形、空洞、色素积累等，基内菌丝产生大量的分生孢子。SM905发酵上清液不影响胶孢炭疽菌孢子的萌发率，但是导致萌发后的菌丝生长稀疏、膨大。盆栽试验结果表明，SM905粉剂100倍液间隔7 d喷施2次对铁皮石斛炭疽病的防效为80.74%，优于10%苯醚甲环唑水分散粒剂800倍液。本研究表明，芽胞杆菌SM905可以作为铁皮石斛炭疽病生物防治用生防菌，具有良好的应用前景。     

茭白叶黑斑病的病原鉴定和防治药剂筛选

In recent years, in addition to brown spot disease, leaf black spot has occurred frequently and seriously affected the yield and quality in the production areas of Zizania latifolia in China. In order to identify the pathogen, diseased samples were collected from Lu'an, Suzhou, Tongxiang, Yuhang, Yuyao, Jinhua, Shengzhou. Finally, 90 fungal strains were obtained by tissue isolation method, in which 25 strains causing black spot disease of Z. latifolia was identified as Nigrospora oryzae by morphological observation, multiple sequence alignment analysis and pathogenicity test. Toxicity test of 12 fungicides commonly used in fields was carried out in laboratory conditions. The results showed that the effect of 250 g·L^-1 prochloraz EC was best, with the EC₅₀ of 0.002 mg·L^-1; followed by 30% Pyraclostrobin SC and 60% Difenoconazole WG, with the EC₅₀ of 0.056 and 0.057 mg·L^-1, respectively. Combined with the inhibitory effect of the 12 fungicides on Ustilago esculenta, 250 g·L^-1 prochloraz EC was the best choice as a control agent. This study provided scientific basis for the identification and control of leaf black spot of Z. latifolia.     

来源于湖北省梨轮纹病菌中真菌病毒多样性检测及其分析

 一些真菌病毒严重影响寄主生长、产孢量、致病力。本研究对来源于湖北梨轮纹病菌携带真菌病毒情况进行分析,旨在挖掘具有生防潜能的真菌病毒资源。随机采集湖北省梨树发病枝干,分离、鉴定获得13个梨轮纹病菌株,其生长速率、致病性存在差异。提取dsRNA检测,发现12个菌株均携带不同大小的dsRNA片段。观察其dsRNA带型,HBWH-14 dsRNA含有1~7 kb 9条带,其他菌株携带的dsRNA条带位置均位于HBWH-14所含dsRNA带型中的某1条或多条对应的条带位置。RT-PCR检测发现部分菌株携带产黄青霉病毒BdCV1、双分体病毒BdPV1、单分体病毒BdTV1以及未分类的BdRV1。本研究未发现梨轮纹菌株所含病毒种类与致病力存在直接的相关性。HBWH-14原生质体脱毒获得后代100%携带的dsRNAs稳定遗传。     

花椒根腐病的病原鉴定与防治药剂筛选

 近几年,根腐病在我国花椒产区大面积发生,严重影响了花椒的产量和质量。为明确引起花椒根腐病的病原,本研究从陕西省凤县花椒示范基地采集花椒根腐病标本,采用组织分离法和致病性检验获得花椒根腐病菌。通过对花椒根腐病菌的形态学观察及ITS、 β-tubulin和TEF1-α序列分析,将花椒根腐病菌鉴定为腐皮镰刀菌(Fusarium solani)。杀菌剂室内抑菌活性筛选结果表明,选用的十种杀菌剂对F. solani的菌落生长均表现出一定的抑制作用,其中以6%丙唑·多菌灵悬乳剂、30%苯甲·丙环唑悬乳剂、50%多菌灵可湿性粉剂和80%代森锰锌可湿性粉剂对花椒根腐病菌的抑制作用较强,EC₅₀值分别为0.48、0.66、1.40和1.61 mg·L^-1。本研究结果为花椒根腐病的有效防控提供了科学依据。