猪裸卵体外胞质成熟研究

[目的]改善猪裸卵的体外成熟质量,为建立稳定有效的裸卵培养体系提供科学依据。[方法]以第一极体排出比例、卵母细胞谷胱甘肽含量、亮甲酚蓝阳性率以及早期胚胎发育潜能等为主要衡量指标研究了卵泡壁颗粒细胞共培养对猪裸卵胞质成熟的影响。[结果]体外成熟结果表明,相对于DO组,DO+MGC组卵母细胞排除第一极体的比例无显著差异,但核成熟的进程得到了改善,更接近于COC组;成熟卵母细胞GSH含量检测结果表明,DO+MGC组平均每个卵母细胞谷胱甘肽含量(光密度1 053.67)与COC组(1 426.00)和COC+GC组(1 541.00)差异不显著,但DO组(724.67)显著低于COC组和COC+GC组(P0.05);G6PDH活性检测结果表明,DO+MGC组BCB阳性卵母细胞比例(88.26%)与COC组(92.75%)以及DO组(82.86%)差异均不显著,但DO组显著低于COC组(P0.05);成熟卵母细胞孤雌激活后的发育结果表明,DO+MGC组卵裂率(94.98%)和囊胚率(43.67%)显著高于DO组卵裂率(52.54%)和囊胚率(8.97%),与COC组卵裂率(97.11%)和囊胚率(38.30%)差异不显著(P0.05);成熟卵母细胞体外受精后的发育结果表明,DO+MGC组卵裂率(72.65%)与DO组卵裂率(63.59%)无显著差异,但DO+MGC组囊胚率(17.79%)显著高于DO组(9.88%)(P0.05)。[结论]卵泡壁颗粒细胞共培养可以显著改善裸卵体外成熟的胞质成熟质量并进而提高后续发育潜力。     

Researoh on the in vitro Cvtoplasmic Maturation of Denuded Porcine Oocytes

[目的]改善猪裸卵的体外成熟质量,为建立稳定有效的裸卵培养体系提供科学依据.[方法]以第一极体排出比例、卵母细胞谷胱甘肽含量、亮甲酚蓝阳性率以及早期胚胎发育潜能等为主要衡量指标研究了卵泡壁颗粒细胞共培养对猪裸卵胞质成熟的影响.[结果]体外成熟结果表明,相对于DO组,DO+ MGC组卵母细胞排除第一极体的比例无显著差异,但核成熟的进程得到了改善,更接近于COC组;成熟卵母细胞GSH含量检测结果表明,DO+ MGC组平均每个卵母细胞谷胱甘肽含量(光密度1053.67)与COC组(1426.00)和COC+ CC组(1541.00)差异不显著,但DO组(724.67)显著低于COC组和COC+GC组(P ＜0.05);G6PDH活性检测结果表明,DO+MGC组BCB阳性卵母细胞比例(88.26％)与COC组(92.75％)以及DO组(82.86％)差异均不显著,但DO组显著低于COC组(P＜0.05);成熟卵母细胞孤雌激活后的发育结果表明,DO+ MGC组卵裂率(94.98％)和囊胚率(43.67％)显著高于DO组卵裂率(52.54％)和囊胚率(8.97％),与COC组卵裂率(97.11％)和囊胚率(38.30％)差异不显著(P＜0.05);成熟卵母细胞体外受精后的发育结果表明,DO+ MGC组卵裂率(72.65％)与DO组卵裂率(63.59％)无显著差异,但DO+ MGC组囊胚率(17.79％)显著高于DO组(9.88％)(P＜0.05).[结论]卵泡壁颗粒细胞共培养可以显著改善裸卵体外成熟的胞质成熟质量并进而提高后续发育潜力.     

颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

试验系统研究了颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。COCs、机械裸卵和自然裸卵的体外成熟率分别为68.3%、45.6%和6.1%,组间差异显著(P<0.05),卵裂率分别为41.5%、8.1%和0,差异显著(P<0.05)。对照组和15×104个/ml、150×104个/ml颗粒细胞组卵母细胞体外成熟率分别为65.9%、60.2%和64.6%,无显著差异(P>0.05),但均显著高于1 500×104个/ml(50.0%)和1.5×108个/ml(30.3%)颗粒细胞组(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系统卵母细胞成熟率为75.8%,显著高于150×104个/ml颗粒细胞条件培养液组(63.4%)和M199培养液组(66.7%)(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系卵裂率为50.0%,显著高于150×104个/ml条件培养液组(36.7%)和M199培养液组(38.2%)(P<0.05)。     

卵丘细胞对活体取卵来源的裸卵在体外成熟中的作用

本文探讨了卵丘细胞对活体取卵(ovumpickup,OPU)来源的裸卵在体外成熟中的作用。实验分3组:自然裸卵组(NO),裸卵独自成熟培养;共成熟组(CM),自然裸卵与A级卵丘卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes,COCs)共成熟培养;非裸卵组(NN),正常AB级COCs成熟后,去除卵丘再进行体外受精与体外培养。结果显示:NN组的成熟率最高,其卵裂率及囊胚率高于NO组,但与CM组相似;CM组的成熟率与NO组没有显著差异,但卵裂率和囊胚率均比NO组高。表明OPU来源的裸卵和A级COCs共成熟能显著改善裸卵的发育能力;卵丘细胞对卵母细胞的促成熟作用可直接作用于裸卵,促进裸卵的成熟及随后的发育。     

db-cAMP和卵丘细胞单层对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育潜力研究

为提高卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的能力,探讨了双丁酰基腺苷酸环化酶(db-c AMP)和卵丘细胞单层共培养对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育潜力。结果表明,成熟培养液中分别添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的db-c AMP时,卵母细胞的体外成熟率依次降低,但浓度为1 mmol/L时的孤雌胚囊胚率(27.03%)显著高于其他各组(P0.05);卵丘细胞单层共培养卵母细胞时,其成熟率、卵裂率及囊胚率(86.00%、89.04%、28.36%)也得到了显著提高;0.4 mmol/L的db-c AMP和卵丘细胞单层共培养时,其成熟率和卵裂率(85.78%和88.95%)与对照组差异不显著,但囊胚率(35.14%)显著提高。0.4 mmol/L的db-c AMP和卵丘细胞单层共培养能够显著提高猪卵母细胞的体外成熟及孤雌胚胎的发育潜力。     

猪卵丘扩展与卵母细胞核成熟关系的研究

 以猪卵丘卵母细胞复合体（COC）为实验对象研究了猪卵丘扩展与卵母细胞核成熟之间的关系,结果表明,（1）全程培养均暴露于激素环境中不利于卵丘的扩展;（2）卵丘扩展良好与卵丘扩展不好的卵母细胞核成熟比例无统计学差异（P>005）;（3）去除卵母细胞的COC培养后,卵丘细胞仍然能发生扩展;（4）培养24h后去掉COC的卵丘细胞不仅不影响卵母细胞的核成熟,而且极体完整的卵母细胞数目还显著增多（P<0.01）;但去颗粒细胞组卵母细胞的质膜不如对照组光滑;（5）带有壁颗粒细胞（mural granulosa cell,MGC）的COC扩展情况明显优于不带MGC的,其中含有极体的成熟卵数也显著高于后者（P<0.01）。     

绵羊成熟卵母细胞GMP玻璃化冷冻影响发育因素的研究

利用GMP法(毛细玻璃管法)冷冻成熟的绵羊卵母细胞,旨在探讨冷冻和解冻处理方法对绵羊成熟卵母细胞发育潜力的影响.对比在玻璃化冷冻液中添加0.3 mol/L蔗糖;卵母细胞冷冻前用7.5 μg/ml CB预处理;卵母细胞去掉颗粒细胞冷冻;以及四步法解冻和三步法解冻对卵母细胞形态完整率、孤雌激活胚发育率的影响.结果显示:玻璃化冷冻液中添加蔗糖孤雌激活卵裂率达到56.70%,极显著高于对照25.40%(P<0.01),桑葚胚率(16.49%)比对照(4.76%)有明显提高(P<0.05);冷冻前用CB进行预处理,解冻后形态正常率为78.78%,明显高于对照61.11%(P<0.05),孤雌激活卵裂率(39.39%)也高于对照组(21.11%);去掉颗粒细胞裸卵与保留颗粒细胞成熟卵母细胞解冻后形态正常率、孤雌激活卵裂率及桑葚胚率、囊胚率之间无显著性差异(P>0.05);四步法解冻和三步法解冻后卵母细胞形态恢复及孤雌激活后的发育率,两组之间差异不显著(P>0.05).在玻璃化冷冻液中添加蔗糖及卵母细胞冷冻前用CB预处理有利于卵母细胞冷冻解冻后形态恢复及孤雌激活后的胚胎发育.     

利用淘汰奶牛卵巢生产体外受精胚胎

以淘汰奶牛卵巢为材料,研究了卵巢采集方法、卵丘细胞和颗粒细胞对卵母细胞体外受精后发育的影响。结果表明奶牛屠宰后取其卵巢,用剖解法(平均9.1枚/卵巢),可比抽吸法(平均6.5枚/卵巢)得到更多的可用卵母细胞(p<0.01)。周围无卵丘细胞包围的裸露卵母细胞经成熟培养和体外受精后,卵裂率为41.8%,但仅27.5%停留在8～16-细胞期,最高发育阶段为16-细胞期;有3层以上卵丘细胞紧密包围的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-OocyteComplex,COC)经成熟培养和体外受精后,卵裂率(64.5%VS54.7%,p<0.01)和囊胚发育率(34.0%VS18.2%,p<0.01)显著高于卵丘细胞包被不全的卵母细胞。在培养液中添加颗粒细胞虽然没有促进牛受精卵的卵裂率,但提高了囊胚率及其细胞数(p<0.01).     

卵丘细胞对牛体外受精效果的影响（英文）

[目的]探索卵丘细胞对牛体外成熟卵母细胞体外受精效果的影响。[方法]试验采用体外成熟后卵母细胞脱除卵丘细胞组、部分脱除组及不脱除组。[结果]与卵丘细胞共培养时,部分脱除组的卵裂率及囊胚率(74.4%±4.1、53.7%±5.1)好于不脱除组(72.7%±5.1、52.4%±3.5),差异不显著(P0.05)、两者都好于全部脱除组(39.6%±4.5、18.8%±4.6),差异显著(P0.05),且都显著优于对照组。卵丘细胞与褪黑素两者联合使用时,效果最佳。部分脱除组的卵裂率及囊胚率(79.8%±3.7、56.5%±5.1)好于不脱除组(78.2%±2.6、55.8%±4.6),差异不显著,两者都好于完全脱除组(48.3%±5.5、22.7%±4.3)及对照组,且差异显著(P0.05)。[结论]该研究对奶牛和肉牛的生产提供了技术支持。     

卵母细胞体外成熟时间对绵羊核移植效率的影响

[目的]为绵羊克隆试验中卵母细胞的体外成熟及去核时间提供参考。[方法]利用盲吸法结合荧光显微镜检查,对绵羊不同成熟时间卵母细胞去核的效率及其后续重构胚的发育进行对比。[结果]体外成熟培养19~21 h的绵羊卵母细胞在成熟率上显著高于体外成熟培养16~18 h(P(0.05),在去核成功率上显著高于体外成熟培养22~24 h(P(0.05);3个试验组在卵裂率、囊胚率上差异不显著(P(0.05),但是体外成熟培养19~21 h的试验组囊胚平均细胞数要显著高于其他2组(P(0.05)。[结论]体外成熟培养19~21 h的卵母细胞较适于作为受体细胞进行绵羊核移植,可以显著提高囊胚的质量。     

亮甲酚蓝筛选对广西巴马小型猪孤雌激活及克隆重构胚早期发育的影响

[目的]探讨亮甲酚蓝(BCB)染色是否可以筛选出发育潜能优秀的卵母细胞.[方法]猪卵丘卵母细胞复合体(COCs)在体外成熟培养前用13μmol/L BCB染色,根据卵母细胞胞质蓝色的有无分为阳性(BCB+,蓝色)和阴性组(BCB-,不着色),以在不含BCB的改良杜氏磷酸盐缓冲液(m-DPBS)中处理90 min为控制对照组,直接培育作空白对照,体外成熟培养后统计各组卵母细胞的核成熟率及孤雌激活胚胎、克隆重构胚胎(供体细胞来自广西巴马小型猪)的早期发育率.[结果]BCB+组卵母细胞的核成熟率(80.8%)显著高于BCB-组(44.2%)和空白对照组(72.4%);BCB+组的孤雌囊胚形成率(32.9%)显著高于BCB-组(10.1%),但与对照组(25.8%)之间无显著差异;BCB+组显微操作核移植胚胎的囊胚发育率(14.1%)显著高于BCB-组(3.4%),但与对照组之间无显著差异;各组手工克隆胚胎发育率之间无显著差异.[结论]BCB染色筛选出的卵母细胞具有较好的核成熟发育潜能,但未能显著改善广西巴马小型猪显微操作及手工克隆胚胎的早期发育.     

亮甲酚蓝染色对水牛卵母细胞体外受精和孤雌激活胚胎发育的影响

[目的]探讨亮甲酚蓝（BCB）染色对水牛卵母细胞体外受精及孤雌激活胚胎发育的影响。[方法]卵丘卵母细胞复合体（COCs）在体外成熟培养前用浓度26μmol/L的亮甲酚蓝染色90 min,然后根据卵母细胞胞质蓝色的有无分为阳性（BCB＋,蓝色）和阴性组（BCB-,不着色）。以未经染色处理的COCs为对照组,控制对照组卵母细胞在含0.4%牛血清白蛋白（BSA）的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中孵育90 min。体外成熟培养后统计各组的成熟率、体外受精和孤雌激活后的发育率。[结果]BCB＋组的成熟率（65.70%）显著高于对照组（59.86%）、控制对照组（58.42%）和BCB-组（48.86%）。在体外受精后的囊胚发育率方面,BCB＋组（27.08%）和对照组（25.49%）差异不显著,但显著高于控制对照组（20.50%）和BCB-组（8.45%）。在孤雌激活后的囊胚发育率方面,BCB-组显著低于其他各组,但BCB＋组、对照组以及控制对照组之间无显著差异。[结论]亮甲酚蓝染色筛选出的阳性卵母细胞具有较好的核成熟发育潜能,但并不能显著提高卵母细胞体外受精及孤雌激活后的胚胎发育率。     

孕马血清促性腺激素对狗卵母细胞体外核成熟的影响

[目的]研究孕马血清促性腺激素(PMSG;eCG)对狗卵母细胞体外成熟效果的影响。[方法]采用切割法收集卵巢表面卵丘卵母细胞复合体(COCs),并且随机分为4组,在添加不同浓度的PMSG的基础培养液(含有10%胎牛血清的DMEM)中,5%CO2,38.5℃培养箱内培养48 h。在含有0.1%透明质酸酶的D-PBS中用细小玻璃管剥离卵丘细胞从而获得裸卵,为了鉴别核成熟期,用4%甲醛溶液固定裸卵15 min,然后用10μg/ml Hoechst33342染色、压片,荧光显微镜下观察核形态。[结果]体外培养48 h后,添加PMSG处理组卵丘扩散明显,但发育到MⅠ-MⅡ的比率都没有显著差异(P(0.05)。100 IU/ml PMSG处理组GVBD期率显著低于对照组。[结论]添加PMSG改善了卵丘扩散的效果,但是没有提高核成熟率,需进一步改进狗卵母细胞体外成熟率的培养体系。     

生长激素和胰岛素对猪卵母细胞体外成熟及卵裂的影响

研究了生长激素(STH)、胰岛素(insulin)单独或者联合作用对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后卵裂的影响。结果表明:STH、胰岛素对卵母细胞体外成熟及孤雌激活后卵裂呈现双重效应。在mNCSU-23基础液中添加0.15μg/mLSTH组的成熟率和卵裂率显著高于对照组及0.01,0.05,0.1,2μg/mL组(P<0.05);添加5μg/mL,8μg/mL胰岛素组的成熟率显著高于对照组及0.5,2,10μg/mL组;添加5μg/mL胰岛素组的卵裂率也显著高于对照组及0.5,2,8,10μg/mL组;0.15μg/mLSTH与2μg/mL胰岛素联合添加组的成熟率和卵裂率最高,同其他组相比,差异显著。     

PDE3与亮甲酚蓝在绵羊卵母细胞体外培养中的应用研究

[目的]探讨磷酸二酯酶3（PDE3）特异性抑制剂Milrinone与亮甲酚蓝染色液（BCB）相结合在绵羊卵母细胞体外培养中的应用。[方法]比较了BCB对绵羊卵母细胞的筛选与传统的形态分级之间的差异,以及对胚胎后期发育的影响;研究了Milrinone对绵羊卵母细胞的最佳抑制时间,并用于BCB-卵母细胞体外培养。[结果]A、B级卵母细胞中BCB＋卵母细胞的比例为64.42%,极显著高于C级卵母细胞的17.00%;BCB＋卵母细胞的成熟率（86.16%）、卵裂率（85.29%）、囊胚率（34.40%）分别极显著高于BCB-卵母细胞（50.94%、36.19%和6.73%）;6 h是Milrinone对绵羊卵母细胞的最佳抑制时间,该试验组体外培养效率显著高于其他组;Milrinone对BCB-卵母细胞抑制培养6 h,极显著提高了体外胚胎发育率。[结论]为提高绵羊卵母细胞体外培养效率提供了依据。     

不同浓度的牛卵泡液对牛卵母细胞体外核成熟率的影响

通过添加不同浓度的牛卵泡液(bFF),探讨了bFF对牛卵母细胞体外核成熟率的影响;并筛选出bTCM-199(10%)培养体系与TCM-199培养体系进行核成熟效果的对比试验。结果表明:20%、30%bFF组处在GV期和MⅠ期卵母细胞比率极显著高于10%组(P<0.01),而卵母细胞核成熟(处于MⅡ期)率10%组显著高于20%和30%组(P<0.01);TCM-199培养体系与bTCM-199(10%)培养体系2组减数分裂各阶段卵母细胞比率基本一致,前者卵母细胞核成熟(处于MⅡ期)率与后者差异不显著(P>0.05)。与bTCM-199(10%)培养体系相比,TCM-199培养体系成分简单,是理想的牛卵母细胞体外成熟培养体系。     

猪卵泡液和促性腺激素处理时间对猪卵母细胞体外成熟的影响

研究猪卵泡液(pFF)的浓度和促性腺激素(FSH和LH)处理时间对猪卵泡卵母细胞体外成熟的影响.结果表明,在猪卵丘细胞-卵母细胞复合体体外成熟培养46～48 h中的后23～24 h去除促性腺激素可有利于卵丘细胞的扩散,但对卵细胞的核成熟无显著影响(P>0.05);添加适量(10%)的pFF对猪卵母细胞体外成熟有一定的促进作用,但添加浓度太高则相对抑制卵子核成熟进程.     

成熟培养基对猪卵母细胞的影响

评估NCSU23和TCM199两种培养基对猪卵母细胞体外成熟、孤雌激活以及核移植重构胚发育的影响。分别以NCSU23和TCM199为基础培养基,向其中添加相同浓度的半胱氨酸、激素和生长因子,作为猪卵母细胞体外成熟培养液,培养44 h(5%CO2、39℃、饱和湿度),挑选第一极体;成熟后的卵母细胞进行孤雌激活和核移植重构胚操作,144 h后观察囊胚数。结果表明,NCSU23组与TCM199组对卵母细胞体外成熟(68.18%和67.55%)、孤雌囊胚率(38.40%和37.60%)与核移植囊胚率(23.79%和21.38%)无显著影响(P>0.05),但是两者对孤雌囊胚细胞数的影响差异显著(分别为38.4和37.6个细胞)(P<0.05)。NCSU23成熟培养基能够使胞质成熟完全,提高囊胚细胞数,有利于妊娠的发生。可见,以NCSU23为基础培养基的体外成熟液有利于猪卵母细胞体外发育。     

卵巢皮质与输卵管上皮细胞对猪卵母细胞体外成熟与体外受精的影响

在猪输卵管上皮细胞（pOECs）与猪卵巢皮质细胞（pOCCs）共培养体系中进行猪卵子体外成熟（IVM）,研究比较了pOECs与pOCCs对猪卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精与胚胎发育的影响。结果显示：pOCCs或pOECs参与猪卵子体外成熟可显著提高卵丘扩散与MⅡ期卵子的比例（P<0.05）,然而GV期卵子的比例却没有显著减少（P>0.05）;pOCCs组内成熟卵子的GSH含量显著高于其余各组（P<0.05）,而GSH在pOECs组与对照组之间差异不显著（P>0.05）;尽管pOCCs和pOECs共成熟可显著降低多精入卵的比例（P<0.05）,但是受精率与雄原核形成率（MPN）在各组间却无显著差异（P>0.05）;pOCCs和pOECs共培养均可以显著提高卵裂率与囊胚发育率（P>0.05）,然而囊胚细胞数在处理组与对照组间没有显著性差异（P>0.05）。研究认为,pOCCs与pOECs共培养体系能显著提高猪卵母细胞IVM质量,降低多精入卵的发生,并提高囊胚发育率。