鱼源性人兽共患吸虫囊蚴感染的季节性分析

为了解齐齐哈尔地区淡水鱼人兽共患吸虫囊蚴感染的季节性差异,笔者自2017年3月份—2018年3月份,每月月初从各个市场及江边售卖点等购买淡水麦穗鱼807尾,采用直接压片法和人工消化法分离鱼肉中的吸虫囊蚴,采取形态学方法对吸虫囊蚴种类进行鉴定,并且对感染囊蚴的种类和感染率进行统计及分析。结果表明:此次调查共检出人兽共患吸虫囊蚴两种,分别为华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴,其中华支睾吸虫囊蚴感染率为44.73%(361/807),东方次睾吸虫囊蚴感染率为32.59%(263/807)。华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴感染差异有统计学意义(P0.05);华支睾吸虫囊蚴感染率和东方次睾吸虫囊蚴感染率四季差异有统计学意义(P0.05)。华支睾吸虫囊蚴一年四季都有不同程度的感染,在8—11月份感染达到高峰,感染强度最大为每克鱼肉含150个囊蚴;东方次睾吸虫囊蚴在9—10月份期间感染最为严重,感染强度最大为每克鱼肉含100个囊蚴。     

粪便中华支睾吸虫虫卵DNA的提取及PCR检测方法的优化

华支睾吸虫病又称肝吸虫病,是由华支睾吸虫寄生在人或多种动物胆管内所引起的一种人兽共患病.目前,华支睾吸虫的分离鉴定主要集中在成虫或囊蚴,对虫卵的研究甚少.采用分子生物学方法成功建立了感染人粪便中华支睾吸虫虫卵DNA的提取方法及华支睾吸虫基因片段PCR检测方法,同时对PCR反应条件进行优化,为从分子水平上检测华支睾吸虫虫卵提供科学依据.     

淡水鱼虾华支睾吸虫囊蚴感染情况调查

采集吉林省白城地区镇赉县周边6个鱼塘的各种鱼类,用直接压片镜检法和人工消化法分别对采集回来的麦穗鱼感染华支睾吸虫囊蚴的情况进行统计调查,结果表明,感染率最高、感染强度最大的鱼塘是四方坨六分场。随即对四方坨六分场鱼塘中各种鱼类华支睾吸虫囊蚴感染情况也采用同样方法进行调查,结果显示,感染率最高的是麦穗鱼、银飘鱼、尖头鱥,均为100%;其次是细鳞鱼,为80%;其他种类的鱼虾均未检测到有华支睾吸虫囊蚴寄生。     

华支睾吸虫后囊蚴cDNA表达文库的构建及鉴定

构建华支睾吸虫后囊蚴cDNA表达文库,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础,也为进一步研究华支睾吸虫后囊蚴感染宿主的信号传导机制、探究其致病机理提供新的起点。从中国东北疫区（镇赉县）麦穗鱼肉里分离收集华支睾吸虫囊蚴,采用Trizol Reagent提取其总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第1链cDNA及第2链cDNA,加EcoRⅠ接头,经XhoⅠ酶切,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接,Gigapack III Gold包装蛋白体外包装,构建华支睾吸虫后囊蚴cDNA表达文库。结果表明,构建的华支睾囊蚴cDNA表达文库的库容量为9.15×10⁵ PFU,重组率为99.5%,扩增后文库滴度为1.6×10¹⁰PFU/mL。成功构建了一高质量的华支睾吸虫后囊蚴cDNA表达文库。     

华支睾吸虫囊蚴标本制作新法

华支睾吸虫囊蚴标本制作新法许正敏（湖北囊凡市卫校）作者在华支睾吸虫囊蚴检查过程中，发现本地区该虫在鱼皮分布最多［１］。华支睾吸虫囊蚴标本传统制作方法是先用人工胃液消化分离出囊蚴──脱水──甘油透明──封片或染色封片［２，３］，此法繁杂染色及分色观察不...     

乌裕尔河流域富裕段麦穗鱼感染的吸虫囊蚴分子生物学调查

为了解乌裕尔河流域富裕段麦穗鱼感染吸虫囊蚴的种类,本研究采集乌裕尔河流域富裕段麦穗鱼,利用人工消化法收集的不同形态的吸虫囊蚴,在显微镜下观察,根据囊蚴的形态特点进行分类。同时分别提取各种囊蚴的总DNA,利用PCR方法扩增其第二内转录间隔区(ITS2)基因序列并进行测序,将获得的基因序列与Gen Bank数据库相应的基因序列进行比对分析,构建系统发生树。结果显示乌裕尔河流域富裕段麦穗鱼主要感染3种吸虫囊蚴,分别为华支睾吸虫、东方次睾吸虫和日本全冠吸虫。本研究进一步证明形态学结合分子生物方法是鉴定淡水鱼中吸虫囊蚴感染种类的有效手段。     

吉林省扶余市松花江流域淡水鱼的华支睾吸虫寄生情况调查

华支睾吸虫病(又称肝吸虫病)是一种危害严重的淡水鱼源性人兽共患寄生虫病,吉林省是我国该病危害最为严重的地区之一,为了解吉林省淡水鱼的感染情况,本试验于2014年9月—2015年6月对吉林省扶余市3个乡镇(长春岭镇、得胜镇、更新乡)的松花江流域及沿江支流的野生淡水鱼感染情况进行了形态学观察与PCR鉴定。进行胃蛋白酶消化法的囊蚴形态学观察;PCR引物的设计及特异性鉴定;华支睾吸虫吉林分离株囊蚴和成虫的PCR鉴定。结果显示,3个乡镇分别获得11种淡水鱼,麦穗鱼、泥鳅、黑鱼、老头鱼、鲫鱼、鲶鱼、嘎牙子、白鲢、虾、白鱼、船钉鱼平均每克囊蚴感染量依次为142.16、0.47、0.05、0.38、0.09、0.14、0.32、0.07、0.42、10.23、39.3个,其中麦穗鱼感染量最高。华支睾吸虫吉林分离株18SRNA的PCR扩增片段与中国广西分离株同源性为98%。     

华支睾吸虫囊蚴SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

为了建立一种特异且敏感的华支睾吸虫囊蚴SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，试验针对华支睾吸虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基1(CSCOⅠ)基因设计特异性引物，筛选最佳引物浓度和退火温度，绘制标准曲线，优化扩增体系和程序建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，并评价该方法的敏感性、特异性、重复性及符合性。结果表明：最佳引物浓度为750 nmol/L,最佳退火温度为57℃。标准曲线的斜率为-3.21,截距为35.23,相关系数(R²)为0.982 3。该方法的最低检出限为1×10² copies/μL;批间和批内变异系数分别为1.53%～2.59%和0.36%～0.76%,表现出良好的重复性；仅标准阳性质粒、华支睾吸虫囊蚴及肝片吸虫出现特异性扩增曲线，具有较好的特异性；与传统压片镜检法比较符合率为96%。说明试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感、特异、稳定，为后续开展淡水鱼感染华支睾吸虫囊蚴的流行病学调查提供了技术支持。     

淡水鱼中3种吸虫囊蚴多重PCR检测方法的建立

为建立同时检测淡水鱼中华支睾吸虫、东方次睾吸虫和日本全冠吸虫的三重PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的各吸虫参考序列中保守区域设计3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了 3种吸虫囊蚴的多重PCR检测方法,并利用该方法对52尾淡水鱼样品中吸虫囊蚴的感染情况进行检测.结果显示,本研究所建立的方法对东方次睾吸虫...     

东北地区华支睾吸虫ITS1基因序列分析

为研究我国东北地区华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)ITS1基因的变异情况及多态性,本研究以采自宾县、大庆、海伦、双城、泰来、同江和长春7个地区的华支睾吸虫为研究对象,PCR扩增ITS1基因,并与GenBank登录的麝猫后睾吸虫、猫后睾属吸虫、东方次睾吸虫、广西株华支睾吸虫、沈阳株华支睾吸虫和韩国株华支睾吸虫的ITS1基因进行比对分析.结果表明,各地区华支睾吸虫样品ITS1基因大小均为661bp,同源性在99.4%～100%之间.构建的系统发生树显示,分支情况与地区距离呈正相关,广西株与其它地区华支睾吸虫所属分支相隔较远,韩国株与东北地区各株相隔较近,海伦株与泰来株,大庆株与沈阳株,长春株与同江株,双城株与宾县株分别位于同一分支.结果显示,ITS1片段除了可作为遗传标记用以鉴定华支睾吸虫科内属间遗传关系,还可以区分属下种间的遗传关系.     

Rapid identification and differentiation of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay

The present study developed and validated a species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the rapid detection and discrimination of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica. The LAMP assay is inexpensive, easy to perform and shows rapid reaction, wherein the amplification can be obtained in 45 min under isothermal conditions of 61 °C or 62 °C by employing a set of four species-specific primer mixtures and results can be checked through naked-eye visualization. The optimal assay conditions with no cross-reaction with other closely related trematodes (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini, Orientobilharzia turkestanicum and Schistosoma japonicum) as well as within the two Fasciola species were established. The assay was validated by examining F. gigantica DNA in the intermediate host snails and in faecal samples. The results indicated that the LAMP assay is approximately 10(4) times more sensitive than the conventional specific PCR assays. These findings indicate that this Fasciola species-specific LAMP assay may have a potential clinical application for detection and differentiation of Fasciola species, especially in endemic countries.     

华支睾吸虫成虫cDNA表达文库的构建与筛选

为了获得华支睾吸虫成虫期强反应原性抗原基因,首先利用λZAP栽体构建华支睾吸虫成虫cDNA表达文库:即从我国东北疫区(镇赉县)家犬胆管内分离收集华支睾吸虫成虫,采用Trizol Reagent提取其总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第1链cDNA及第2链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与栽体λZAP Express连接,体外包装后成功获得我国东北疫区华支睾吸虫成虫cDNA表达文库.文库容量为1.5×106pfu,重组率为99%,插入片段长度在0.4～2.0 kb之阀,扩增文库的滴度为1.5×1010pfu/mL.然后利用免疫学方法对该cDNA表达文库进行筛选:以自然感染华支睾吸虫的人血清为抗体探针,从2.0×105个重组噬菌体筛选强反应原性抗原基因,对筛选出的强反应原性克隆进行测序,利用相关分子生物学软件进行序列分析.共获得41个阳性克隆,测序结果分析表明,这些cDNAs根据其编码的蛋白可分为以下几种,即与来自华支睾吸虫的甘氨酸-2、脯氨酸-2及Cs44抗原高同源的基因及分别与来自Nematostella vectensis的未知蛋白、转录延伸因子及果蝇CG3446基因编码蛋白较低同源性的基因.本研究结果为进一步对华支睾吸虫抗原的生物学特性研究及应用奠定了理论基础和实验依据.     

当归苯丙氨酸解氨酶基因片段克隆和组织特异性表达分析

苯丙氨酸解氨酶(PAL)在高等植物苯丙烷类代谢中具有重要作用,与植物体内很多重要的次生代谢产物的合成密切相关。当归主要药效成分阿魏酸是苯丙烷类代谢途径中的产物之一。为了探究阿魏酸生物合成和积累的机理,本研究克隆了当归苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)部分序列,运用荧光定量PCR方法分析该基因在当归不同组织部位的表达差异。根据已经克隆的植物PAL保守序列设计一对扩增引物,以当归叶片总 RNA 为模板,采用反转录PCR(RT-PCR)方法扩增出PAL片段并连接到pGEM-T Easy载体上,转化大肠杆菌DH5α,阳性克隆经PCR检测后测序,得到一段706 bp的序列(登录号: KJ000258),内含终止密码子TAA,编码232个氨基酸,与GenBank中注册的伞形科植物珊瑚菜等6个物种的PAL核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性都在80%以上;运用SYBR Green荧光定量PCR方法,以当归肌动蛋白基因Actin为内参基因,检测PAL在当归不同组织中的表达量,结果显示PAL在叶片中表达量最高,其次是茎和根,叶片和茎中表达量分别是根中表达量的7.5和2.7倍。     

马泰勒虫病PCR检测方法的建立和应用

为寻求一种快速、有效的马泰勒虫 (Theileria equi,T.equi) PCR检测方法。基于马泰勒虫18S rRNA基因序列,在其V4高变区设计特异性引物Te-18F、Te-18R,通过PCR技术获得了531 bp的核酸片段。用该引物对马泰勒虫、马泰勒虫和驽巴贝斯虫混合样本、驽巴贝斯虫、尤氏泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫和瑟氏泰勒虫基因组模板进行特异性试验。同时对马泰勒虫基因组模板进行不同浓度稀释后扩增,以便于确定试验的敏感性。用本试验建立的方法与常规显微镜镜检方法对45份马属动物血样进行检测。特异性试验显示,在被检测的9个样本中,只有马泰勒虫及马泰勒虫和驽巴贝斯虫混合模板中扩增出了符合大小的特异核酸片段。驽巴贝斯虫、尤氏泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫和瑟氏泰勒虫的扩增结果均为阴性。灵敏度试验结果表明,PCR对马泰勒虫的扩增效率可达到10^-13。对本试验建立的PCR检测马泰勒虫方法评估结果显示,PCR对马泰勒虫的检出率为17.78%(8/45),显微镜镜检结果只有8.89%(4/45)两者的符合率为100%。本试验建立的马泰勒虫PCR检测方法不失,为一种好的检测方法。     

Molecular survey of Dirofilaria immitis and Dirofilaria repens by direct PCR for wild caught mosquitoes in the Republic of Korea

Adult mosquito collections using New Jersey light traps and Black-hole light traps were conducted to determine the potential vectors and the relative mosquito infection rates of Dirofilaria immitis and Dirofilaria repens in Gyeonggi and Gangwon Provinces, Republic of Korea, 2005. Dirofilaria spp. were confirmed by polymerase chain reaction (PCR) using species-specific primers for D. immitis and D. repens. Minimum field infection rates (MFIR) [MFIR = (number infected pools/total number of mosquitoes) x 1000] of 12 pools/2059 total number mosquitoes (5.8) and 21 pools (10.1) of the wild caught mosquitoes were positive by PCR for D. immitis and D. repens, respectively. Dual infections of both D. immitis and D. repens were detected by PCR in eight pools (3.9). Anopheles sinensis sensu lato (includes An. sinensis s.s., An. pullus, An. kleini, An. belenrae, and An. lesteri), An. sineroides, Aedes vexans nipponi, Culex pipiens and Armigeres subalbatus were found to be infected and are potential vectors of D. immitis and D. repens in Korea. Infections observed in mosquitoes represent potential health risks for domestic animal and human populations.     

补播禾草对玛曲高寒沙化草地植物多样性和生产力的影响

为了解补播对高寒沙化草地植物多样性和生产力的影响,于2006和2007年在甘肃玛曲开展了多种牧草的草地补播改良试验。结果表明,补播对物种丰富度影响不明显,但使草群密度明显增大,补播后各处理Pielou均匀度指数、Simpson指数、Shannon-Weiner指数均减小,其中单播中华羊茅、混播中华羊茅和垂穗披碱草多样性指数显著减小。补播后地上生物量比对照显著增加,其中3种禾草混播后地上生物量增加了55.74％。补播使草地的经济价值得以提高,有利于高寒沙化草地的恢复和生态环境的保护。     

中华鳖常见疾病的诊断及其综合防治

结合常见的鳖病病原、病症,对PCR、核酸杂交及ELISA等快速诊断技术进行分析,寻找适合中华鳖病原的早期预警方法,进而探讨优良的中华鳖养殖管理模式及鳖病的综合防治方法,以期应用于生产,促进养鳖业的快速发展.