牛皮蝇Hypodermin A基因在大肠杆菌中的表达

从牛皮蝇Ⅱ期幼虫中提取总RNA,进行RT-PCR扩增牛皮蝇Hypodermin A基因.将扩增基因进行克隆测序,构建原核表达栽体pET30-HA,转化大肠杆菌BL21(DE3).用IPTG诱导表达,得到表达量达到全菌蛋白35%以上的特异性蛋白.SDS-PAGE分析表明,表达产物大部分以包涵体形式存在.Western-blot检测结果表明,获得的重组蛋白为重组Hypodermin A,具有较好的免疫活性.     

重组H5亚型流感病毒HA1抗原的制备及其特性分析

为获得重组表达的H5亚型流感病毒血凝素(HA1)抗原.将PCR扩增的H5亚型流感病毒HA1基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pETHA1-H5.结果显示,转化pETHA1-H5的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下以包涵体形式表达了HA1蛋白.HA1重组蛋白能与不同禽类(鸡、鸭和鹅)H5亚型流感病毒阳性血清发生特异性反应,同时以HA1重组蛋白为抗原制备的单克隆抗体具有与H5亚型完整病毒粒子抗原反应的能力,说明重组表达的HA1蛋白保留了自然条件下H5亚型流感病毒的抗原特征.将重组表达的HA1蛋白作为ELISA抗原检测禽血清中的H5亚型流感病毒抗体,以HI试验结果为参考,两者的符合率为96.6%,证明HA1重组蛋白作为ELISA检测抗原是可行的.     

猪乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白的原核表达、纯化及活性检测

在大肠杆菌BL21(DE3)中表达乙脑病毒(JEV)EDⅢ蛋白、镍柱纯化并检测表达蛋白。采用RT-PCR方法扩增EDⅢ基因片段,构建重组表达载体p ET-28a-EDⅢ并转化到BL21(DE3)菌,经IPTG诱导蛋白表达,表达可溶性产物经NiNTA亲和层析纯化,最后通过SDS-PAGE和Western-Blot检测表达蛋白。结果成功构建原核表达载体p ET-28a-EDⅢ;EDⅢ蛋白在BL21(DE3)菌已表达,经Ni-NTA获得纯化蛋白,并经Western-Blot检测具有反应活性。     

大肠杆菌志贺毒素stxB融合基因的构建及其高效表达

利用PCR方法，从肠出血性大肠杆菌O157：H7的基因组DNA中，分别扩增出Stx1B和Stx2B亚基的结构基因片段，然后再通过PCR将这2个片段连接起来，并定向克隆到表达质粒pET28a的Nco1和EcoR 1位点之间，构建了重组表达质粒pMB1。将重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3)中，对重组菌株BL21(pMB1)用IPTG进行诱导表达，并对最佳诱导时间进行了探索。SDS-PAGE电泳检测结果表明。重组菌株表达出了16300的目的蛋白Stx2B-L-Stx1B；经薄层扫描分析表明，表达量约占菌体总蛋白的68．4％，且目的蛋白为包涵体表达，表达量约占细菌沉淀的84．6％。研究还表明，未用IPTG诱导的BL21(pMB1)菌株也可有少量目的蛋白的基础表达。不同诱导时间的结果表明，在3～7h的诱导时间内，目的蛋白的表达量没有明显变化。     

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)表达载体的构建及其诱导表达

利用PCR技术将透明颠菌血红蛋白基因(vhb)克隆到融合表达裁体pET28a，在大肠杆菌BL21(DE3)表达。重组蛋白分别在30℃和37℃诱导表达，30℃诱导获得可溶性表达。结果表明：在30℃，1．5mmol／L和2．5mmol／LIPTG诱导下，诱导4—8h透明颠菌血红蛋白可获得高表达——透明颠菌血红蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的18．7％和27．7％。     

产气荚膜梭菌β1毒素基因克隆与表达

以C型产气荚膜梭菌中PCR扩增出β1毒素基因,构建了表达质粒p GEXKG-β1,将构建的KG-β1转化受体菌BL21(DE3),得到重组菌株BL21/KG-β1。对重组菌株诱导的表达产物进行了SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达毒素蛋白。     

蛇毒类凝血酶基因在大肠埃希菌中诱导表达及影响因素

将蛇毒类凝血酶基因(TLE)亚克隆到原核表达载体pMAL-p2X上,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达;同时采用不同的OD值、诱导时间I、PTG浓度和诱导温度对尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因重组表达质粒pMAL-p2X进行了条件优化。研究发现,不同的诱导时间、IPTG诱导浓度和诱导温度与融合蛋白表达量有很大关系。SDS-PAGE结果显示,当OD值为0.5,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导温度为37℃时,诱导3 h后蛋白表达量最高,超出此范围可使表达量显著减少。在优化诱导条件后,融合蛋白的表达量可达全菌总蛋白量的66%。     

猪圆环病毒2型ORF2可溶性表达条件的优化

为探索猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因在大肠杆菌中高效可溶性表达的条件,扩增ORF2基因构建重组表达质粒p ET30a-ORF2,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态获得重组表达菌;通过改变菌体培养温度和时间、诱导温度和时间、溶解氧量、IPTG及CaCl_2浓度,实现目的蛋白高效可溶性表达。结果表明:重组表达质粒p ET30a-ORF2经酶切及测序证明构建正确,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,其最佳表达条件为:在500 mL培养瓶中加入200 mL LB卡那霉素阳性培养基,菌体于37℃培养4 h后,分别加入IPTG及Ca Cl2至终浓度为0.6 mmol/L及0.06 mol/L,30℃诱导表达4 h;重组Cap蛋白的最高表达量占总蛋白的55.9%。说明优化后可实现猪圆环病毒Cap蛋白的可溶性表达,这为进一步研究该蛋白的结构及其生物学特性奠定了基础。     

IBDV VP2基因重组质粒pBV220表达条件的优化

采用三角瓶小量法振荡培养,对含传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组质粒pBV220在大肠埃希菌BL21内表达条件进行优化.在37℃时诱导,对起始OD600值(0.40±0.025～0.65±0.025)进行筛选;在42℃时诱导,对起始OD600值(0.40±0.025～0.65±0.025)进行筛选;在37℃和42℃时诱导,分别对诱导时间(5、6、7、8 h)及待选培养基(R1、R2、R3)进行筛选.以菌体湿重和菌体VP2蛋白表达水平两个指标进行统计分析及综合评价.结果表明,37℃时诱导,最适宜起始OD600为0.45±0.025,最佳诱导时间为7 h,最佳培养基是R1;42℃时诱导,最适宜起始OD600为0.40±0.025,最佳诱导时间为5 h,最佳培养基是R2.42℃时的每一诱导时间组菌体湿重和VP2表达水平都显著低于37℃时.因此,以重组质粒pBV220的大肠埃希菌BL21表达IBDV VP2基因,在37℃时诱导表达要比42℃时好.     

旋毛虫T3223-6 cDNA的表达及鉴定

利用PCR技术将T3223-6 cDNA扩增克隆到原核表达载体pET-28a,将重组质粒转入克隆菌Nova-blue,提取质粒进行酶切和测序鉴定后转入表达菌BL21star(DE3).用1 mM IPTG诱导培养重组表达菌,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析,检测重组蛋白的表达情况.用旋毛虫感染猪血清和正常血清,通过western blotting检测重组蛋白的反应原性.结果表明:经IPTG诱导后重组转化菌的裂解产物出现44 kD左右的表达带,大小与理论值相符;western blotting检测结果显示重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别,具有反应原性.     

猪细环病毒2型衣壳蛋白的原核表达及纯化

本试验通过在大肠杆菌中表达衣壳蛋白,确定最优表达条件并对其进行纯化。用PCR法扩增猪细环病毒2型（TTV2）ORF1抗原基因,定向克隆至质粒pGEX-4T-1中,获得重组质粒pGEX-4T-1-ORF1。经双酶切鉴定及测序正确后转化到BL21(DE3)工程菌中,获得衣壳蛋白大肠杆菌表达株。IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,并对影响重组蛋白表达的3个因素,即诱导时间、诱导温度和IPTG浓度进行优化,确定最优表达条件。重组表达质粒PCR及双酶切鉴定结果显示衣壳蛋白原核表达载体构建正确。重组融合蛋白分子质量约80 ku,主要以包涵体形式存在。37 ℃诱导5 h表达量最多,IPTG浓度对表达量无明显影响。蛋白质串联肽谱分析检测氨基酸序列与GenBank中公布的TTV2 ORF1基因序列翻译的氨基酸序列相对应,且可被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别。该融合蛋白首次用KCl染色切胶回收法对表达的融合蛋白进行纯化,纯化效果较好,性价比高。结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-ORF1重组质粒,衣壳蛋白得到了高效表达及纯化,为间接ELISA的建立及单克隆抗体的研制提供了抗原。     

熊源粪肠球菌EfaA基因的原核表达

试验旨在构建EfaA基因的原核表达质粒,并对其进行表达。根据GenBank中粪肠球菌EfaA基因序列（登录号：U03756）设计合成1对引物,利用PCR法扩增、克隆EfaA基因,并进行生物信息学分析,将EfaA基因亚克隆于pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。结果发现,试验成功获得大小为873 bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得分子质量约为59 ku的EfaA重组蛋白,以37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最大。经Western blotting分析发现,具有较好的反应原性。本试验成功构建原核表达质粒pGEX-4T-EfaA,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中成功表达。     

日本血吸虫Ⅴ型胶原蛋白α1链的原核表达分析

目前广泛应用的各类胶原及胶原蛋白多为人工提取的方法获得,为了得到高纯度原核表达的胶原蛋白,本研究构建了血吸虫V型胶原蛋白（Schistosoma japonicum type V collagen,Sj Col V）（a1）基因AY815998.1的原核表达质粒,并对其进行了原核表达。结果表明SjColV（a1）蛋白能在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中高效表达,但原核表达的融合蛋白不够稳定,且存在形式多样。本文就其表达情况进行了分析,并纯化得到原核表达的全长rSjColV（a1）,用V型胶原蛋白的单抗对其进行鉴定,同时分析其在？80℃保存的稳定性,研究结果为SjColV（a1）的深入研究和利用提供了一定的理论依据。     

H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37 ℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409 600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。     

新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白基因密码子的优化及原核表达

试验旨在优化新型鸭呼肠孤病毒（new-type duck reovirus,NDRV）XX株σB蛋白的原核表达系统,并评价sσB蛋白的免疫原性。根据已测得的NDRV-XX的σB蛋白基因序列,在不改变氨基酸序列的前提下,按照大肠杆菌密码子偏好性对σB蛋白全基因进行优化、合成并连接至pET-32a（+）质粒中,构建原核表达重组质粒pET-32a（+）-sσB,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达并优化表达条件。SDS-PAGE结果显示,最佳诱导表达时间、温度及IPTG浓度分别为3 h、32℃和0.25 mmol/L;可溶性分析结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中。表达菌经超声破碎、变性、复性和Ni²⁺柱亲和层析后,得到纯度高于90%的sσB可溶性蛋白,sσB重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）菌株上的表达量较σB蛋白提升了14.6%,前者占细菌总蛋白量的32.3%。Western blotting结果显示,sσB重组蛋白具备NDRV抗原免疫反应原性。本试验成功构建并优化了NDRV-XX株σB蛋白的原核表达系统,提高了σB蛋白的表达量,并获得具有良好NDRV抗原免疫反应原性的σB重组蛋白,为后续NDRV σB蛋白功能及其应用的深入研究、基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

乳糖诱导重组鸡γ干扰素基因在大肠杆菌中的表达

本文考察了乳糖代替IPTG诱导鸡γ干扰素(ChIFN-γ)在重组大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性。分别对乳糖作为诱导剂时的诱导时机、乳糖浓度、诱导持续时间和添加方式等方面进行了分析,并在最优诱导条件下与IPTG诱导进行比较。结果表明,工程菌在对数生长中后期(OD600为1.5)添加终浓度为2g/L的乳糖诱导7h对蛋白的表达和菌体量最为有利。由于乳糖本身可作为碳源被菌体利用,分批流加乳糖效果优于一次性添加。与IPTG诱导相比,乳糖诱导的蛋白表达量为29.8%,稍低于IPTG的32.3%,诱导后蛋白表达时间也有所滞后,但收获的菌体量则显著高于IPTG诱导,约为1.21倍,显示出了乳糖作为诱导剂的自身的优势。研究结果证明乳糖可以作为诱导剂应用于重组鸡γ干扰素的工业化生产,同时也为其它重组基因工程药物的生产提供了有益的参考和借鉴。     

猪细小病毒VP2的原核表达与多克隆抗体制备

克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。     

羊种布鲁氏菌Wzt基因的克隆及原核表达

为进一步研究Wzt蛋白在光滑型脂多糖合成路径中的作用,本试验利用PCR技术,以羊种布鲁氏菌16 M株基因组为模板,扩增出大小为759 bp的Wzt基因片段,将其连入pMD20-T载体,测序正确后构建重组质粒pET-28a-Wzt,转化E.coli BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导其表达,最后用Western blotting鉴定蛋白。结果显示,扩增出的Wzt基因片段大小为759 bp,与GenBank中登录的羊种布鲁氏菌16 M株Wzt基因序列(登录号:AF047478.1)同源性为99.87%,证明成功克隆了Wzt基因,同时成功构建了pET-28a-Wzt原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)工程菌中表达了Wzt蛋白,诱导得到的融合蛋白大小约为30 ku,位于25～35 ku之间,与目的蛋白大小一致,结果表明成功表达了目的基因。     

布鲁氏菌外膜蛋白16基因的克隆及原核表达

为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16, Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507 bp的目的基因片段,凝胶回收纯化目的片段,连接入pMD20-T质粒,转化E.coli DH5α并测序,测序正确后再亚克隆入pET-28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-Omp16,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,最后用Western blotting分析方法鉴定诱导得到的蛋白。结果表明,成功构建了pET-Omp16原核表达载体,并在E.coli BL21中表达了Omp16基因,诱导得到的蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明成功表达了目的基因。     

羊传染性脓疱病毒CEV112基因的克隆与原核表达

为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。