利用SSR技术构建多花黑麦草品种指纹图谱

通过构建我国多花黑麦草主栽品种的SSR标记指纹图谱数据库,以实现对多花黑麦草品种的快速、准确鉴定.本研究利用SSR标记,基于多态性高、稳定性强和连锁群分布均匀的原则,从100对多花黑麦草(Lolium multiflorum Lam.)基因组来源的SSR引物中,筛选出12对引物用来构建了21个多花黑麦草品种(系)的指纹图谱.12对SSR引物共扩增出108种多态性基因型,多态性比率达94.15％,每对引物的基因型从5～22种不等,平均每对引物扩增出9种基因型,多态性信息量(PIC)变幅为0.744～0.934,平均为0.843,此12对引物可以在构建多花黑麦草品种DNA指纹数据库作为核心引物推荐使用.21个多花黑麦草品种(系)基因型间遗传相似性系数在0.4956～0.8571之间,UPGMA聚类分析表明,在相似系数0.69处可将全部材料分为3大类.7对引物在9个品种上具有唯一特征带,采用15-08C单对引物即可将21个多花黑麦草品种完全区分开,该对引物不仅多态性高(PIC=0.934),且具备多个品种的特征谱带.基于该引物建立了供试品种指纹图谱标准模式图,每个品种具有唯一的指纹图谱(带型),为牧草品种的审定和保护以及选配优良杂交组合培育新品种提供了重要的理论依据.     

SSR标记的彩色马铃薯遗传多样性分析及指纹图谱构建

彩色马铃薯(指块茎的皮或肉为红、蓝、紫、橙色等)近年来日益为育种工作者所关注,很多彩色马铃薯品种(系)从形态学上难以鉴定是否为同一基因型,给育种工作带来诸多不便。本研究利用SSR标记对50份彩色马铃薯(Solanum tuberosumL.)材料进行了遗传多样性分析及指纹图谱构建。研究筛选出56对马铃薯SSR引物,对50份材料的基因组DNA进行PCR扩增,共检测出236个等位位点,其中多态性位点230个,多态性比率达97.46%。分析显示,基因型间遗传相似性系数在0.50~1.00之间。UPGMA聚类分析表明,在相似系数0.63处可将全部材料分为3大类。利用5对核心引物构建了50份供试材料的指纹图谱,并证明其属于44个基因型的,为彩色马铃薯资源鉴定和利用提供了依据。     

山东省46个花生品种SSR指纹图谱构建与遗传多样性分析

为从分子水平上快速鉴别花生品种和选配优良杂交组合,以山东省审定的46个花生品种为材料,利用微卫星(SSR)标记进行DNA指纹图谱的构建和遗传多样性分析。从788对SSR引物中筛选出50对多态性高、稳定性好、谱带清晰的引物,共检测到175个等位位点,其中122个为多态性位点,多态性比率达70.52%;每对SSR引物扩增出的等位位点数为2~7个,多态性信息量变化范围为0.6753~0.8412,平均为0.823。此外,利用14对引物可将46份材料完全区分开。聚类分析表明,在相似系数0.77处,所有供试材料聚为一类,在相似系数0.80处,仍有76%的材料聚在一起。利用SSR标记构建的指纹图谱可为花生种质资源管理及育种实践提供依据。     

节水抗旱稻品种DNA指纹图谱的构建

为了解节水抗旱稻品种的多样性,利用SSR分子标记技术对24份节水抗旱稻和2份普通水稻品种进行DNA指纹图谱构建和遗传多样性分析。结果表明,24对引物共扩增出96个多态性片段,平均每对引物可检测到4个等位基因,每个SSR位点可以检测到2~6个等位基因。引物多态信息含量(PIC)的变化范围为0.36~0.75,平均值为0.58。指纹图谱显示至少可以利用RM71、RM72、RM336、RM337、RM1195和RM5414这6个核心标记的不同组合鉴别区分26份供试材料。聚类分析结果表明,26份材料间遗传相似系数为0.54~0.98,在遗传相似系数0.65处可以将供试材料分为籼、粳两类,较好地反映了供试材料的亲缘关系。本研究结果为节水抗旱稻新品种保护、真伪鉴定及亲本选配提供了参考。     

基于SSR标记的我国主栽日本栗品种(系)遗传结构分析和指纹图谱构建

为解析我国主栽日本栗品种资源的遗传多样性并构建其指纹图谱,本研究通过毛细管电泳和高质量的17个SSR分子标记对日本栗品种资源进行位点检测。结果显示,日本栗与茅栗具有较近的种间亲缘关系。在59份日本栗品种(系)中共检测到131个等位位点,每个标记平均有7.706个等位位点;多态信息含量(PIC)变幅为0.375~0.815,平均值为0.605;供试日本栗品种表现出高的遗传多样性。系统发育树、群体结构和主坐标分析结果一致,支持中国境内的部分日本栗品种(系)独立形成一个分支,且大多品种为杂交资源。此外,本研究根据多位点匹配分析确定了CmSI0922、CmSI00702和CmSI0658为核心引物,并利用这3个核心引物构建了59份日本栗品种(系)的指纹图谱。综上所述,相比其他栗属植物,日本栗分布范围较狭窄,但其具有丰富的遗传多样性,且品种资源间存在广泛的基因流。本研究成功构建了59份日本栗品种(系)资源的具有唯一对应关系的指纹图谱,为栗属植物的资源鉴定和保护利用提供了有力支撑。     

河南粳稻品种SSR指纹图谱的构建及遗传差异分析

为了建立河南粳稻品种的DNA指纹图谱,了解河南粳稻种植品种的遗传多样性,本研究利用均匀分布于水稻(Oryza sativaL.)12条染色体的37对SSR引物,以河南1963～2010年间主要推广种植的37个粳稻(O.sativaL.ssp.japonica)品种为材料,进行简单序列重复(SSR)指纹图谱构建和遗传多样性分析。结果表明,33对引物具有特异多态性片段,共检测到114个等位基因,平均每位点3.53个等位基因;引物多态性频率为0.054～0.739。37个品种的遗传相似系数为0.627～0.992,平均为0.812。17个品种都至少具有1对SSR特征引物,其余20个品种的鉴定需要结合不同的SSR引物。利用19对核心SSR引物构建的指纹图谱能逐一区分出36个粳稻品种。采用非加权类平均法(UPGMA)进行聚类分析,在遗传相似系数0.710处可将37个品种分为2大类,河南选育品种基本都聚到同一大类群,表明河南推广的粳稻品种遗传基础狭窄。     

猪基因组AFLP指纹图谱的构建

摘要：对猪（Sus scrofa）基因组AFLP指纹图谱构建的各项条件进行了优化,包括双酶切消化、接头连接、预扩增和选择性扩增、凝胶电泳银染技术及荧光标记检测法等,建立了稳定的猪基因组DNA的AFLP指纹图谱构建方法,采用E32/T32引物组合在45个猪种基因组混合DNA中检测到28个多态标记。     

利用核心简单重复序列(SSR)标记分析无籽西瓜品种的DNA指纹及遗传多样性

为构建无籽西瓜品种的DNA指纹,实现无籽西瓜品种的快速准确鉴定,客观评价品种的遗传多样性,本研究利用核心SSR标记对我国54份无籽西瓜(Citrullus lanatus)主栽品种进行了分析。结果显示,23对多态性引物共扩增出63种基因型,基因型数2～5个不等,平均2.74个;平均多态性信息量(PIC)为0.39,变化范围为0.04～0.67,有5个品种具有特征谱带;54个品种遗传相似系数变化范围为0.643 9～1.0,平均0.859 3,参试品种具有较高的遗传相似性;组合23对引物,除无法区分雪峰花皮无籽与郑抗无籽1号、郑抗新1号与广西3号、黒宝无籽与桂冠1号,其余品种均能一一区分开,利用PIC0.4的10对引物构建了5份主要参试品种的DNA标准指纹图谱;采用类平均法进行聚类分析,在相似系数0.82处,可将54个品种分为7大类。本研究建立了参试品种的标准DNA指纹图谱,为我国无籽西瓜品种的真实性鉴定和知识产权保护提供了技术基础。     

杂交水稻亲本分子身份证及SSR指纹数据库的建立

本研究利用GB/T20396-2006推荐的48对SSR核心标记,对133份杂交水稻亲本(包括部分常规品种)进行SSR分析,根据引物在133份材料中扩增的片段大小,构建了各品种的分子身份证和指纹图谱,该身份证由48位数字或数字与字母组合组成,代表了48对引物在该品种中的扩增情况。将品种的身份证信息与品种的形态学特征特性等信息相结合,构建了具查询功能的SSR指纹网络数据库。该SSR指纹数据库除具有品种基本信息查询、品种分子身份证查询、品种间相似率查询和身份证核对等基本功能外,还可指导杂交水稻品种真实性和纯度鉴定,分析亲本间遗传相似性,为杂交稻新组合的选育提供亲本选配的参考。该数据库的建立,不仅为检测单位和育种工作者提供了一个便利的网络数据交换和共享平台,也为品种的选育、试验、管理、评价、仲裁提供技术支撑和科学参考。     

基于石蒜属转录组序列的SSR分子标记开发应用

为开发石蒜属简单重复序列(SSR)分子标记,并研究SSR引物在石蒜属内的通用性,本研究对石蒜属石蒜、忽地笑、中国石蒜、长筒石蒜、换锦花、香石蒜6个种质转录组测序,检测SSR位点并设计引物,通过PCR扩增和毛细管电泳判断引物的有效性和多态性,绘制石蒜属17个种质资源的指纹图谱并对杂交后代的真实性进行早期检测。结果表明,共获得404 481条Unigenes,利用数据库进行同源比对和功能注释,并对Unigene进行SSR位点挖掘和分析,共检测到59 612个SSR位点。其中,单核苷酸重复>二核苷酸重复>三核苷酸重复,分别占SSR总数的62.88%、20.06%和14.66%,四核苷酸及以上重复单元相对较少。选取并合成8对荧光引物进行PCR扩增,通过毛细管电泳检测发现,8对荧光引物共检测到60个多态位点,多态位点数平均为7.50,多态性信息含量(PIC)值变化范围为0.148 0~0.940 8,平均值为0.593 0。利用引物扩增带型组合法构建了石蒜属17个种资源的指纹图谱,其中引物QZ209可区分所有供试材料,并可用于杂交后代鉴定。本研究开发的SSR标记具有丰富的多态性,在石蒜属植物的资源多样性分析、杂交种鉴定及遗传图谱的构建应用中具有重要意义。     

大白菜InDels标记开发及其在剩余杂合体鉴定中的应用

大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)参考基因组序列的公布及测序成本的降低为大规模开发插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)标记提供了可能.本研究以性状差异明显的大白菜自交系He102与06-247为亲本,开展了全基因组重测序、标记开发和验证工作.二者测序深度分别为10×和8×,经筛选共获得330 218个InDels差异位点,出现频率为1.2个/kb,其中有11 238个差异位点位于编码区,包括5 184个差异基因,每个基因平均包含2.2个差异位点.分别以He102与06-247测序数据中筛选出的多态性InDels位点为参照,从10条染色体上随机选择933个位点进行了PCR扩增及电泳检测验证.结果表明,测序深度对假阳性率有直接影响,以测序较深的材料中筛选到的差异位点为参照,其验证结果的假阳性率亦较高,反之则较低.本研究中以He102与06-247为参照选择InDels位点验证的平均假阳性率分别是51.9％和22.5％.从933个位点中共筛选出593个在亲本之间实际表现为多态性的位点,这些差异位点中有375个位于编码区,是潜在的功能性标记.利用上述差异位点,检测了He102与06-247衍生的F7代重组自交系群体,明确了F7代各株系在593个位点的纯/杂合状态,为利用剩余杂合株系精细解析和精准定位大白菜耐抽薹、抗病毒、抗干烧心等重要农艺性状奠定了基础.     

大白菜表达序列标签SSR标记分析*

对大白菜（Brassica campestris L．ssppekinensis）13007个EST序列进行拼接共得到7714个片段重叠群（contig），其中10．4％（890个）非冗余EST含有SSR标记（EST-SSR），标记间平均间隔距离为3．9kb，单、双和三核苷酸重复序列大约各占1／3左右。CDS所包含的三核苷酸重复序列最多，而且AAG／CTT重复序列的含量最高。通过同源性比较分析，获得功能已知的SSR-ESTs774个，共计含有846个SSR，其中50．2％位于5＇-UTR，31．4％位于3＇-UTR，18．4％位于CDS。实验选取123个SSR座位设计引物，利用芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）的高抗和高感大白菜F6代自交系材料各2份，分析EST-SSR标记多态性。结果表明，其中37个标记可进行有效扩增，但是没有表现出多态性，23个标记（18．7％）至少在1份材料中具有多态性。对这些EST-SSR标记在大白菜和其它芸薹属植物的系统发育关系分析、遗传作图和基因定位的应用进行了讨论。     

大白菜抗软腐病基因BrWRKY33植物表达载体的构建

利用农杆菌侵染法获得抗软腐病转BrWRKY33基因大白菜,首先要构建植物表达载体。本实验根据BrWRKY33基因的序列及pROK2表达载体的酶切位点设计引物(FN/RN),获得BrWRKY33基因,然后将该基因连接到克隆载体pGEM-TEasy,重新构建了克隆载体T-WRKY。经测序及酶切验证,选取PCR反应中错配率最低的产物,构建了表达载体pROK2-WRKY,并将该表达载体转入到根癌农杆菌EHA105中,并对其转化子进行了鉴定。结果表明,PCR扩增获得目的基因BrWRKY33全长约1443bp,PCR及酶切结果鉴定表明克隆载体T-WRKY已经重新构建成功。表达载体的PCR及BamHⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定表明有4个重组子表现阳性,表明目的基因已经插入到pROK2表达载体,表达载体构建成功。PCR鉴定表明表达载体pROK2-WRKY已经转入根癌农杆菌EHA105中。本实验结果将为进一步研究大白菜抗软腐病基因的转化奠定基础。     

大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列抽薹相关基因表达差异的cDNA-AFLP分析

抽薹开花时间是大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)的重要性状,未熟抽薹直接影响大白菜的产量和品质.本研究以添加结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)4号染色体片段的大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列为材料,结合抽薹性鉴定,获得了45株耐抽薹和15株易抽薹植株;利用cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)技术,对不同春化处理的耐抽薹和易抽薹植株叶片差异表达片段进行分离,获得了126条与抽薹性相关的差异表达条带,这些差异包括条带的有无和表达量的差异;通过差异条带回收、克隆和测序,获得了74条差异表达序列.同源性比对结果表明,61条差异表达序列具有同源序列,其中41条差异表达序列功能预测涉及代谢、能量、细胞物质运输、信号转导、表达调控、DNA修饰、细胞周期等,20条差异表达序列功能未知;13条在NCBI中找不到同源序列,可能是一些新基因.本研究获得了耐抽薹大白菜-结球甘蓝易位系,为耐抽薹大白菜新品种的培育提供新材料;同时获得了耐抽薹和易抽薹材料间的差异表达序列,为获得影响大白菜抽薹性的关键基因,揭示大白菜抽薹开花机制提供支撑.     

菜心BrcuFCA基因的克隆与表达分析

本文以菜心（Brassica campestris L.ssp.chinensis（L.）Makino var.utilis）为实验材料,比较了Trizol法、改进Trizol法及改良SDS法提取菜心总RNA的效果。结果表明改进Trizol法集中了操作简单、耗时短、所需试剂种类少,且完整性好,产量和纯度均高等多重优点,成为提取菜心总RNA首选方案。同时文章以甘蓝型油菜及其它物种的FCA保守区设计引物,将质量高的菜心总RNA反转录合成cDNA,通过RT-PCR从菜心的早、晚熟品种中均克隆得到与开花有关的基因片段,将之命名为BrcuFCA,片段长1001bp,GenBank登录号为EU700363,与甘蓝型油菜及拟南芥FCA氨基酸同源性分别达到了98%和82%。另一方面,本研究还利用半定量RT-PCR研究了BrcuFCA不同时空表达特性,并结合已发表的开花调控遗传途径中两个关键基因BrcuFLC和BrcuFRI时空表达特性研究结果,推测菜心主要的抽薹开花途径不是春化和FRI-依赖途径,而很可能是自主开花途径。本研究为菜心抽薹开花分子机理的研究提供理论依据。     

大白菜BrTCP24基因的克隆与功能分析

近年来,由于家庭结构的变化,市场对小株型大白菜的需求日益迫切.开展负调控叶球大小发育相关基因的克隆与功能研究有助于加快小株型大白菜品种的选育进程.本研究利用RT-PCR方法从大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)自交系福山包头叶片中分离了一个TCP第二亚族成员基因,命名为BrTCP24.BrTCP24基因编码区内无内含子,开放阅读框(ORF)全长1 221 bp,预测编码406个氨基酸.利用MEGA4.0软件将BrTCP24与拟南芥(Arabidopsis thaliana)TCP家族基因进行进化分析发现,BrT-CP24与AtTCP3同属于一个分支,在进化上具有较近的亲缘关系.用DNAMAN软件对BrTCP24和AtTCP3蛋白进行多序列联配分析发现,二者的氨基酸一致性可达到55.17％,在保守的TCP结构域其一致性可高达91.53％.这种进化上的亲缘关系和序列上的保守性,暗示二者可能具有类似的生物学功能.通过半定量RT-PCR分析发现,BrTCP24基因在大白菜的根、茎、莲座叶、包叶、盛开的花、受精后10 d的果夹和花蕾中均有表达,其中莲座叶中表达量最高,根、包叶、盛开的花、受精后10d的果夹和花蕾中的表达量次之,短缩茎中表达量最低;另外,在5 μmol NAA处理的12h内BrTCP24的表达水平未发生明显变化.为进一步研究BrTCP24基因的功能,我们构建了转化拟南芥的正义表达载体(35S::BrTCP24),并转入拟南芥中.通过卡那霉素筛选以及基因组DNA PCR鉴定,共得到17株转基因拟南芥植株.通过对其中5株的RT-PCR分析发现,它们都能够转录表达BrTCP24基因.利用荧光实时定量PCR方法对部分转基因植株的插入拷贝数进行检测发现,BrTCP24基因以单拷贝形式插入拟南芥基因组.进一步研究发现,与野生型拟南芥相比,过量表达BrTCP24基因可导致转基因拟南芥的下胚轴和叶器官明显减小.此外,过量表达BrTCP24基因抑制了与器官大小相关基因ANT、AtEXP10、AtGRF5、AtGIF1和CycD3;1的表达.这些结果表明,大白菜BrTCP24基因可能通过抑制细胞的生长参与调节植物器官大小的发育.     

苜蓿重要农艺性状关联分子标记研究进展

将不同品种的优良性状通过品种间的杂交集中到一个品种中是育种工作的主要目标,而利用基因型选择代替传统的表型选择将大大加快育种进程和提高育种效率,其中,DNA标记的获得是进行DNA标记辅助育种的重点。随着作物分子标记辅助育种技术的快速发展,苜蓿（Medicago sativa L．）重要性状关联的分子标记研究也取得了很大进展。本文就苜蓿草产量、抗病（虫）害、抗逆性和繁殖特性等主要农艺性状关联的分子标记研究进展进行了综述,主要包括RFLP（DNA－DNA杂交）、RAPD和SSR（PCR）以及AFLP（PCR与限制性酶切技术结合）等分子标记,最后还就苜蓿分子标记辅助育种（marker assisted selection,MAS）所面临的限制因素及其在苜蓿品种改良中的应用前景进行了探讨。     

大白菜抽薹相关基因BrFLC1的KASP标记开发

为了提高大白菜耐抽薹品种的分子育种效率,本研究针对大白菜抽薹相关基因BrFLC1第6个内含子的第一个碱基(Pi6+1)G-A的SNP变异开发进行高通量检测的竞争性等位基因特异性PCR(KASP)标记。结果表明,开发的KASP标记BrFLC1-KASP1可有效将晚抽薹类型材料Y177-12(G)和早抽薹类型材料Y195-93(A)分为2组。利用BrFLC1-KASP1标记可以对57份大白菜材料的基因型进行有效鉴别,且鉴定结果与酶切扩增多态性标记(CAPS)G-MvaI以及直接测序法的鉴定结果完全一致。综上所述, BrFLC1-KASP1标记在大白菜材料中具有通用性,且具有准确率高、成本低、效率高的特点。本研究结果对大白菜耐抽薹性的分子标记辅助选择具有重要的育种实践价值。     

结球白菜带柄子叶外植体不定芽离体再生能力的遗传分析

解析控制植物不定芽离体再生能力的遗传因素,有助于从根本上提高离体培养困难材料的不定芽再生能力,是植物基因工程遗传改良的基础。本研究以结球白菜4个纯合亲本及其杂交后代的带柄子叶为外植体,建立了高频率离体不定芽再生技术。据此我们还对白菜不定芽再生能力进行遗传分析,并开展亲本与后代杂种的离体培养及反应研究,包括对培养基的激素需求,不定芽形成频率,不定芽形成数量,芽形态等系列特征。研究结果表明,杂种与亲本在培养基的激素浓度上有类似需求;杂交后代的不定芽再生率均至少高于一方亲本,在一些组合中可以高于双亲;在适宜的杂交组合及培养条件下,结球白菜带柄子叶外植体的不定芽再生率可以达100％,每一外植体上的不定芽数达3～7个。方差分析表明,结球白菜的不定芽离体再生能力存在基因的加性效应。     

Characterization of a USDA Kentucky Bluegrass (Poa pratensis L.) Core Collection for Reproductive Mode and DNA Content by Flow Cytometry

Kentucky bluegrass (Poa pratensis L.) is an important turf and forage grass species with a facultative apomictic breeding behavior. In this study, mature seed and leaf tissue from 38 accessions of a USDA core collection of Kentucky bluegrass were analyzed with flow cytometry to characterize the reproductive mode and DNA content for each accession. Major reproductive pathways for each accession were determined based upon the presence and the position of the peaks observed and the known methods of reproduction for Kentucky bluegrass. While the majority of the accessions exhibited facultative apomictic reproductive behavior with a combination of reduced, zygotic and unreduced, parthenogenic embryo production, obligate sexual or obligate apomictic accessions were also found to be present in this core collection. In addition, reduced, parthenogenic and unreduced zygotic embryos were also detected in several accessions. Flow cytometric analysis of somatic tissue revealed a large range of DNA variation within this core collection. We also examined the sensitivity of flow cytometry in analyzing bulked samples containing a large number of plants with varied DNA content and determined that flow cytometry can effectively detect a plant having a different DNA content within a 15-plant bulk sample. Overall the combination of mature seed and somatic tissue analysis generated important information for the Kentucky bluegrass core collection and can be an effective and affordable tool to characterize even greater numbers of Kentucky bluegrass accessions.