杀鲑气单胞菌灭活疫苗的制备及其在大菱鲆体内的免疫效果

为了预防大菱鲆疥疮病,本研究将杀鲑气单胞菌菌株HHSM1905经甲醛灭活制备成灭活疫苗,通过腹腔注射途径免疫健康大菱鲆;对免疫后大菱鲆血清抗体效价、血清溶菌酶(LZM)活性、酸性磷酸酶(ACP)活性及疫苗保护率进行测定;以β-actin为内参,对免疫相关基因(IL-1β、TLR-5、MHCⅠ、MHCⅡ-α、CD4)表达情况进行定量PCR分析。结果显示,在免疫后2周时,疫苗组血清抗体效价显著高于对照组并达到最大值;疫苗组LZM活性在免疫2周时达到峰值,4周时仍与对照组保持显著差异;疫苗组ACP活性在免疫后的2周达到峰值,与对照组差异显著;灭活疫苗相对保护率(RPS)为72.72%。免疫组与对照组相比,IL-1β、TLR-5、MHCⅠ、MHCⅡ-α、CD4的表达量均呈上调趋势,与对照组差异显著。本研究成功制备了大菱鲆用杀鲑气单胞菌灭活疫苗,其对大菱鲆疥疮病能够起到一定的预防作用,可为大菱鲆养殖过程中疾病预防提供新方法。     

大西洋鲑杀鲑气单胞菌的分离鉴定

从皮肤溃烂的大西洋鲑(Salmon salar)肌肉、肝、肾分离到一致病性的菌株(AB080226),经人工感染实验证实其为该病的病原菌,研究了该菌的形态、生理生化特征并对其16SrDNA序列进行了在线Classifer和Blast分析。结果显示:该菌为革兰氏阴性杆菌,葡萄糖氧化发酵阳性,氧化酶检测阳性,0%NaCl生长;能利用甘露醇,不具运动性,能发酵麦芽糖,葡萄糖产酸阳性,精氨酸双水解酶阳性,苯丙氨酸脱氨酶阴性;该菌属于气单胞菌属的细菌,在系统发育树上与杀鲑气单胞菌形成一个簇群,同源性高达99.9%以上。综合形态学、生理生化特征及16SrDNA序列鉴定其为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。     

杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种PCR检测方法的建立

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种重要的鱼类致病菌,可以感染多种海淡水鱼类。杀鲑气单胞菌包括5个亚种,目前常用的生理生化特征和16S rDNA序列分析方法很难实现亚种的快速精确区分。为实现杀鲑气单胞菌亚种的快速鉴定和检测,针对我国常见的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A. salmonicida subsp. salmonicida)和杀日本鲑亚种(A. salmonicida subsp. masoucida),本研究开发了其特异性的PCR检测方法。根据Gene Bank已公布的杀鲑气单胞菌基因组信息,选择杀鲑亚种phoB基因和杀日本鲑亚种LOC111476736基因作为目标基因,根据其序列设计特异性引物,进一步对PCR反应的退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度和酶浓度5个方面进行了优化,并测试了该方法的特异性、敏感性和应用效果。结果显示,2对引物分别可以扩增出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种522 bp的phoB特异性基因片段和杀日本鲑亚种515 bp的LOC111476736特异性基因片段。杀鲑亚种特异性引物最适退火温度为64 ℃,10 µmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/µL KOD酶的最适添加量分别为1.5、2、1.5和0.5 µL。杀日本鲑亚种特异性引物最适退火温度为64 ℃,10 µmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/µL KOD酶的最适添加量分别为0.75、1、1.5和0.5 µL。以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、杀鲑气单胞菌其他亚种等14种其他水产病原菌或常见环境菌为模板进行PCR检测,均无特异性条带。该方法对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测灵敏度为12.8 CFU/反应(菌体)或17.6 fg/反应(DNA),对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的检测灵敏度为23.8 CFU/反应(菌体)或27.2 fg/反应(DNA)。利用杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种分别对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行人工感染实验,感染后取病鱼组织进行PCR检测,结果显示,本方法可以从感染后的大菱鲆中分别检测到相应病原。综上所述,本研究建立了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的特异性PCR检     

杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种胞外产物毒性及免疫原性分析

用玻璃纸平板法提取了杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种Aeromonassal monicida masoucida的胞外产物（ECP）。毒性试验证实,ECP对剑尾鱼Xiphophorus helleri具有致死性,其半致死量（LD50）为4.72μg蛋白/g体重。SDS-PAGE表明,ECP由13条蛋白带组成。利用大鼠抗ECP血清进行的Western-blot印迹显示,组成ECP的13条蛋白带中有7条具有免疫原性,能够引发机体的免疫应答反应产生抗体,其分子量分别为88、70、42、39、36、22和15kDa。     

杀鲑气单胞菌对鱼类致病性的研究

正气单胞菌属属于弧菌科,广泛分布于自然界中,可从土壤、淡海水、生活污水中分离,常引起人类腹泻,脑膜炎等疾病。基于16sr RNA系统进化树鉴定发现共31种,杀鲑气单胞菌是嗜冷无动力群的代表种。杀鲑气单胞菌属气单胞菌科、气单胞菌属,是一种不能运动,兼性厌氧的革兰氏阴性菌,广泛分布于自然界中。其是气单胞菌属中最早被鉴定的致病菌,疫苗是目前防     

12种中草药提取物对杀鲑气单胞菌的抑制效果

为观察中草药对杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的体外抑菌效果,采用水煎煮法提取黄柏、黄芩等12种中草药活性成分,首先采用纸片法判断中草药有无抑菌作用,然后使用试管二倍稀释法测定具有抑菌效果的2种中药的最小抑菌浓度。结果表明,黄芩和连翘抑菌效果较好,黄芩的最小抑菌浓度为10 mg/mL,连翘的最小抑菌浓度为20 mg/mL,其余10种中草药抑制杀鲑气单胞菌效果不佳。     

患病细鳞鱼杀鲑气单胞菌的分离与鉴定

从患病细鳞鱼(Brachymystax lenok)的病变组织处分离到1株致病菌,经过分离培养,生化鉴定,16 S rRNA序列分析和人工感染实验确定该病原菌为杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes)。采用20种药物进行药敏分析,结果显示:分离菌株对阿米卡星、哌拉西林、恩诺沙星等9种抗生素敏感;对环丙沙星、诺氟沙星等4种抗生素中度敏感;对卡那霉素、青霉素、氨苄西林等7种抗生素耐药。     

鲤鱼杀鲑气单胞菌病的诊断和防治

<正>2013年12月成都某养殖场的鲤鱼出现病症并有少数死亡,本文从患病鱼的临床症状、病原菌的诊断及治疗过程等方面进行小结,以期为鲤鱼细菌性疾病的诊断和临床疾病的防治提供科学的参考。一、临床症状患病的鲤鱼采自成都市某养殖场,体长26厘米、体重370克。于12月上旬发病。体表严重出血,     

杀鲑气单胞菌对大西洋鲑游泳行为和血细胞数量的影响

为探讨利用鱼类行为及血细胞数量变化预警杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)病害发生的可行性,监测了生产中感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑(Salmo salar L.)的游泳行为,以及杀鲑气单胞菌攻毒后大西洋鲑血细胞数量的变化。实验采用同一养殖基地和同一批次的大西洋鲑,其中现场实验鱼选自生产车间健康的和感染杀鲑气单胞菌的养殖鱼,攻毒实验中处理组实验鱼每尾背肌注射100μL、浓度为3.05×107CFU/m L的菌液,对照组注射等体积灭菌生理盐水。现场实验表明,感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑临界游泳速度较健康鱼低26.7%(P0.05),摆尾频率与游泳速度的线性回归方程的斜率也存在显著差异(P0.05)。攻毒实验表明,从攻毒的第4天开始,处理组大西洋鲑白细胞、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞数量较对照组均发生显著变化,其中第6天的变化最为显著,白细胞总数、粒细胞数分别降低了2.8%和43.9%(P0.05),淋巴细胞数及单核细胞数分别升高了63.3%和23.9%(P0.05),且处理组4种血细胞数随时间呈现显著的线性变化(P0.05)。研究结果表明通过监测大西洋鲑游泳行为(临界游泳速度和摆尾频率)以及血细胞相关指标的变化可快速判断其健康状况,为病害的早期预警提供依据。     

杀鲑气单胞菌一新亚种的生物学特性及系统发育学分析

从石鲽（Kareius bicoloratus L．）细菌性败血感染症的病鱼（濒死及死亡不久）中分离到相应病原菌，进行形态特征、理化特性等较系统的表观分类学指征鉴定及代表菌株DNA中G＋Ct001％的测定。同时，选择代表菌株进行16S rRNA基因的分子鉴定，测定16S rRNA基因序列、分析相关细菌相应序列的同源性，构建系统发生树。结果表明，分离鉴定的60株菌为杀鲑气单胞菌的一个新亚种（subsp．nov．），定名为杀鲑气单胞菌杀鲽亚种（Aeromonas salmonicida subsp．flounderacia subsp．nov．）。代表菌株HQ010320-1及HQ010320-5的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的杀鲑气单胞菌的同源性在99％和100％。     

宽体金线蛭杀鲑气单胞菌的药物敏感性试验

正随着国内外制药公司以及临床医学等方面对宽体金线蛭需求的增加,其市场价格居高不下,在此背景下其人工养殖在国内一些地方迅速兴起,养殖的规模和集约化程度也逐年提高。但与此同时,多种疾病尤其是细菌性疾病的发生对宽体金线蛭的人工养殖产生了较大影响。本试验采用12种常用渔药对从宽体金线蛭患病个体病灶分离鉴定的致病菌——杀鲑气单胞菌进行药敏试     

不同来源杀鲑气单胞菌毒力因子的比较基因组学研究

自凡纳滨对虾养殖水体中分离得到1株杀鲑气单胞菌YK-48,为确定YK-48与在鞍山养殖场金鱼体内分离出来的AS.17和烟台大西洋鲑体内分离出来的S68和S121等不同来源的杀鲑气单胞菌的毒力基因特征之间是否存在差异,对YK-48的形态、生理生化特征和药物敏感性进行分析,随后进行全基因组测序,对4株杀鲑气单胞菌进行基因组...     

杀鲑气单胞菌可视化重组酶聚合酶扩增检测技术的建立

本研究根据杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁载受体(fstA)基因的保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与侧向流试纸条(lateral flow strips,LFS)相结合的可视化快...     

河川沙塘鳢病原杀鲑气单胞菌致病性及感染后宿主免疫相关基因差异表达分析

为探明2021年3月常熟某养殖场河川沙塘鳢(Odontobutis potamophilus)疾病暴发的原因,本研究从患病鱼体内分离到优势菌株,通过形态观察、理化特性测定及gyrB基因同源性分析鉴定优势菌,同时通过人工感染试验、组织病理观察、毒力因子及毒力基因检测确定其致病性,并测定分离菌的耐药性和感染后河川沙塘鳢免疫相关基因表达变化。结果显示：引起河川沙塘鳢大量死亡的病原菌为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。代表菌株G2-4-1对河川沙塘鳢的LD₅₀为1.8×10⁶ CFU/mL;该病原菌感染可引起河川沙塘鳢肝脏、脾脏、肾脏和鳃组织出现明显的变性、坏死和炎性细胞浸润;该菌株携带aer、hly、exu等毒力基因,且具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脂酶、明胶酶和溶血素活性,但不具有DNA酶活性;耐药性分析发现,分离菌G2-4-1对青霉素G、氨苄西林、苯唑西林等8种药物耐药,对克拉霉素和大观霉素2种药物中介,对恩诺沙星、氟苯尼考等24类药物敏感;免疫相关基因表达分析显示,在感染初期MHCⅡB、MyD88、TLR和SOD在鳃...     

杀鲑气单胞菌的实时定量PCR检测方法的建立和应用

选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物和探针.以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线.通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct＝-3.1574lgX 43.6841(相关系数R2=0.992).实时定量PCR的检测限为6个细菌.建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应.杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值.     

养殖刺参溃疡病杀鲑气单胞菌的分离、致病性及胞外产物特性分析

从患溃疡病的养殖刺参(Apostichopus japonicus)病灶处分离出1株优势菌H1,以浸浴、创伤浸浴、体腔注射和体壁肌肉注射等方式进行感染实验,证实菌株H1为养殖刺参溃疡病病原菌,并证明该菌通过体表创伤侵入的方式感染刺参,以创伤浸浴和体壁肌肉注射感染的LD50(半数致死量)分别为2.26×107CFU/尾和1.80×107CFU/尾。经形态学观察、生理生化特性分析和mini API系统鉴定,确定菌株H1为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida ma-soucida)。提取菌株H1的胞外产物(ECP)进行致病性实验,结果表明ECP可导致刺参死亡,其对刺参的LD50为5.24μg蛋白/g体质量。H1-ECP具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、几丁质酶和淀粉酶活性,并具有溶血素活性;对底物偶氮酪蛋白(Azocasin)作用的酶比活力可达到674.5活力单位/mg蛋白,最适作用温度为50℃;对热不稳定,70℃作用30 min时,酪蛋白酶活性降到0;100℃作用30 min,ECP对刺参的毒性消失;ECP酶活可被10 mmol/L EDTA完全抑制,可被5 mmol/L PMSF抑制98.8%,Ca2 和Mg2 可使酶活性分别提高约9%和4%。结论认为,该病原菌通过体表创伤侵入方式感染宿主刺参,菌株H1胞外产物是其对刺参致病的因子之一。     

半滑舌鳎溃疡病原杀鲑气单胞菌的分离鉴定与药敏试验

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)是广受我国消费者认可的名优鱼类,具有很高的营养价值和经济价值,然而,随着工厂化养殖模式的不断发展,疾病成为制约半滑舌鳎养殖业健康发展的关键因素,其中,体表溃疡病为其常见病症。从严重溃疡病半滑舌鳎体内分离到1株优势菌株HX0416,该菌可在TCBS培养基上生长,并可在绵羊血平板上形成清晰的β-溶血环;经过16S rRNA和rpo D基因序列同源性分析并结合生化特性鉴定为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。健康半滑舌鳎幼鱼感染试验表明,该菌对半滑舌鳎具有较强致病性,感染72 h(1.04×106cfu·m L-1)对攻毒鱼的致死率达91.7%。药敏试验结果显示,该菌对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星等喹诺酮类和头孢曲松、头孢吡肟等头孢菌素类药物比较敏感,而对硫酸新霉素、土霉素等氨基糖苷类和四环素类药物多重耐药,尤其是对磺胺甲噁唑、氨苄西林等磺胺类和β-内酰胺类药物严重耐药。     

β-葡聚糖对杀鲑气单胞菌感染后虹鳟应激过程的调节作用

为研究不同浓度的β-葡聚糖对感染杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)应激过程的调节作用,在虹鳟饲料中添加不同浓度的β-葡聚糖(0,0.05%,0.1%,和0.2%),投喂42 d后感染杀鲑气单胞菌,在感染后第2,4和6天取样检测血清应激指标的变化,第7天时统计虹鳟的存活率。结果表明,添加β-葡聚糖能显著提高感染杀鲑气单胞菌后虹鳟的存活率,其中0.2%剂量的保护效果最好(P0.05)。感染后第4天β-葡聚糖组的血清总蛋白(total protein,TP)浓度显著高于对照组(P0.05)。0.1%和0.2%组的血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)活性在感染后第2天达到峰值,早于0.05%和对照组。0.1%和0.2%组血清髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性在感染后显著上升,而0.05%和对照组却显著下降(P0.05)。β-葡聚糖组在感染后血清乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)活性一直显著低于对照组(P0.05)。β-葡聚糖组血清甘油三酯(triglycerides,TG)和总胆固醇(total cholesterol,TCH)感染后下降程度显著低于对照组(P0.05)。感染后第4天,β-葡聚糖组的血清尿素氮(urea nitrogen,BUN)浓度显著低于对照组(P0.05)。总胆红素(total bilirubin,T-BIL)浓度在感染后显著下降(P0.05),其中0.2%组下降幅度最小。各组肝脏和脾脏热休克蛋白70基因(heat shock protein 70,HSP70)表达量在感染后都显著升高(P0.05),0.1%和0.2%组表达峰值出现时间早于其他组,且其峰值高于其他组峰值。综上所述,本实验中,添加β-葡聚糖能显著提高感染杀鲑气单胞菌的虹鳟的存活率和有效减弱细菌感染引起的机体应激反应,其中0.2%剂量的保护效果最好且对应激过程的减弱效果最明显(P0.05)。     

山莨菪碱提高嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫鲫的效果

为研究山莨菪碱作为佐剂在细菌灭活疫苗浸泡免疫中的作用,将山莨菪碱和嗜水气单胞菌全菌灭活疫苗联合浸泡免疫异育银鲫,首次浸泡免疫7d后加强免疫1次.通过实时荧光定量PCR检测第2、4、7、11、14和21天脾脏中IgM、IL-1β、C3、C-凝集素以及溶菌酶的mRNA表达量,并在第21天进行同源菌株活菌攻击实验.结果显示,山莨菪碱组第4天IgM和IL-1 β的表达量达到最高值,分别为28.3和332.7;而无佐剂疫苗组第11天IgM和IL-1β达到最高值,分别为56.1和791.8.山莨菪碱组的补体C3、C-凝集素以及溶菌酶的表达量都显著高于无佐剂组和对照组,且表达持续时间长.活菌攻击实验表明山莨菪碱组的相对免疫保护率可达80.0％,显著高于无佐剂组的56.0％.结果表明,山莨菪碱与嗜水气单胞菌灭活疫苗共同浸泡免疫银鲫,可以增强脾脏中IgM、IL-1β、C3、C-凝集素以及溶菌酶基因表达,提高银鲫相对免疫保护率.